目的：　　 探讨青藤碱(Sinomenine，SIN)联合甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)抑制类风湿关节炎骨破坏的作用及机制。　　 方法：　　 实验一：　　 建立Ⅱ型胶原蛋白诱导的SD大鼠关节炎模型，随机分为模型组（生理盐水灌胃）、青藤碱组（正清风痛宁120mg/kg.d，灌胃）、MTX组(1mg/kg.w，腹腔注射)、联合组(正清风痛宁+MTX组，正清风痛宁120mg/kg.d和MTX1mg/kg.w)，另设7只作为正常对照组。首次免疫注射第21天开始给药。采用关节评分法评估关节炎症程度；并用ELISA法分析大鼠血清中OPG、RANKL、IL-17、IL-1α、IL-6、MMP-1、MMP-3、MMP-13的表达水平；大鼠关节HE染色的组织病理变化及免疫组化比较RANKL、OPN表达的变化。　　 实验二：　　 从RA患者滑膜组织分离培养FLS，用不同质量浓度的SIN(1，0.1，0.01，0.0001mg/ml)与MTX(1，0.1，0.01，0.001mg/ml)单独或联合干预。用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测细胞增殖情况；用流式细胞术检测细胞凋亡情况；用半定量RT-PCR的方法检测FLS中NF-KB受体活化因子配体(RANKL)、骨保护素(OPG)的mRNA表达水平。　　 实验三：　　 从健康人外周血中分离PBMC，用不同质量浓度的SIN(1000，100，1OuM)与MTX(1OuM)单独或联合干预，用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测细胞增殖情况；用RANKL（60ng/ml）、M-CSF（20ng/ml）诱导PBMC分化成破骨细胞(OC)，加入不同质量浓度的SIN与MTX单独或联合干预，第15d终止培养，ELISA法测定各加药组细胞上清液中分泌的MMP-9水平；同时细胞固定行TRAP染色，观察药物干预对于OC分化的影响；用定量RT-PCR的方法检测PBMC中破骨细胞分化转录因子NFATclmRNA的表达水平。　　 结果：　　 实验一：　　 1．造模后，大鼠关节炎肿胀程度在第21d最为明显，然后逐渐消退，在第35d左右会出现第2个炎症高峰。SIN组、MTX组和联合组均可减轻关节肿胀，与造模组比较，关节炎指数评分在第46d均有明显下降（P＜0.05）。　　 2．与模型组比较，MTX组、联合组可明显抑制大鼠血清IL-1α的表达水平(P＜0.05），IL-6表达水平也有下降，但差异无统计学意义(P＞0.05）；与MTX组比较，联合组IL-1α、IL-17水平显著降低(P＜0.05）。　　 3．与模型组比较，SIN组、联合组都可明显抑制血清MMP-3和MMP-13的产生，MTX组MMP-13水平降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与MTX组相比，联合组血清MMP-3的表达水平下降（P＜0.05）。　　 4．与模型组比较，SIN组、MTX组和联合组外周血OPG水平均明显升高，MTX组可降低血清RANKL的表达水平，三组OPG/RANKL的比值显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)：与MTX组相比，联合组OPG/RANKL比值升高(P＜0.05)。　　 5．与正常组比较，模型组炎性组织侵润关节腔隙，使得腔隙变窄。SIN组、MTX组和联合组均能改善炎性细胞的侵润，联合组能更有效抑制CIA大鼠滑膜关节炎症与组织破坏。　　 6.与正常组比较，模型组滑膜组织OPN、RANKL蛋白表达显著增高（P＜0.05）；与模型组比较，联合组、MTX组、SIN组均能降低OPN、RANKL蛋白的表达(P＜0.05）；与MTX组相比，联合组OPN、RANKL蛋白的表达明显下降(P＜0.05)。　　 实验二：　　 1.各不同质量浓度药物组对RAFLS的增殖均有显著的抑制作用(P＜0.05)；但在0.001mg/ml至1mg/ml的浓度范围内，同种药物干预组（SIN单用、MTX单用、SIN与MTX联合）的抑制作用与药物浓度并无明显正相关性；SIN0.1mg/ml+MTX0.1mg/ml组较其他非联合用药组对RAFLS的抑制作用显著增强(P＜0.05)。　　 2．流式细胞仪检测各组凋亡细胞百分率结果显示：空白对照组25.3％，MTX组(MTXO.1mg/ml)28.4%，SIN组(SIN0.1mg/ml)32.3%，联合组（MTX0.1mg/ml+SIN0.1mg/ml）34.7%。各加药组凋亡细胞百分率均高于空白对照组，但SIN组和联合组明显诱导RAFLS凋亡(P＜0.05)；与MTX组比较，联合组凋亡细胞百分率有明显增多(P＜0.05)。　　 3.RT-PCR结果显示：与空白组比较，MTX组（MTX0.1mg/ml）、SIN组(SIN0.1mg/ml)、联合组(MTX0.1mg/ml+SIN0.1mg/ml)RANKL电泳条带均弱；联合组OPG电泳条带较空白组强。联合组能够有效下调RAFLS的RANKLmRNA表达，并上调其OPGmRNA表达(P＜0.05)。　　 实验三：　　 1．加药组对PBMC增殖的影响，MTT结果显示各浓度组药物（包括联合给药），在不同药物组处理细胞48h后，并未影响细胞的增殖(P＞0.05)。　　 2．加药组对OC的分化均有不同程度的抑制作用，ELISA结果显示，高浓度SIN与MTX(SIN1OOOuM+MTX10uM)合用时，能够明显抑制MMP-9的分泌，其他给药组分泌的MMP-9未显示出差异；该浓度的药物处理诱导分化的PBMC，TRAP染色后显微镜下观察分化成熟的OC数目，结果显示联合组(SIN1000uM+MTX10uM)与对照组和单独用药组比较OC数目显著减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 3.RT-PCR结果显示：与对照组及MTX组比较，给药24h后，SIN联合MTX(SIN1OOOuM+MTX10uM)能够有效下调PBMC中的NFATc1mRNA表达(P＜0.05)。　　 结论：　　 实验一：　　 SIN与MTX联合给药对CIA大鼠关节肿胀有明显的防治效应，能够较好地控制炎症发生发展，可能与其对血清IL-1、IL-6、IL-17等抑制作用有关；协同提高外周血OPG、OPG/RANKL比值、抑制MMP-3和MMP-13的产生；抑制关节血管翳的形成和炎性因子的侵润，下调滑膜组织RANKL及OPN的表达水平。提示SIN联合MTX对类风湿关节炎的软骨和骨有协同骨保护作用。　　 实验二：　　 本实验表明SIN与MTX联用对RAFLS具有协同抑制效应，并可能由此实现对RAFLS介导的骨破坏的治疗作用。　　 实验三：　　 本实验表明SIN与MTX联用通过抑制外周血中单核细胞NFATc1基因的表达，减少MMP-9分泌，从而抑制OC的分化，而且该抑制作用有药物浓度依赖关系。