论文部分内容阅读
目的： 诺卡菌是一种机会致病菌，随着其感染率的增加以及耐药现象的出现，逐渐引起人们的重视。鉴于16s rRNA基因在诺卡菌近缘种分型方面的缺陷，以及环丙沙星耐药鼻疽诺卡菌菌株的发现，本论文对中国疾病预防控制中心传染病预防控制所生物安全实验室分离并保存的诺卡菌进行研究，旨在分析secA1基因在诺卡菌菌种中的鉴定分型能力，研究其在临床鉴定中的应用价值；并对鼻疽诺卡菌关于喹诺酮类抗生素环丙沙星的耐药机制进行初步探索，为指导临床合理使用抗生素以及控制耐药菌株的传播提供科学依据。 方法： 1. secA1基因用于诺卡菌菌种鉴定分型的研究： 对59株诺卡菌的secA1基因进行 PCR扩增，扩增片段纯化后测序，并从GenBank数据库下载32株诺卡菌secA1基因序列进行补充，采用 Lasergene7.0软件对所有序列计算种内与种间相似度水平，并用MEGA6.06软件的N-J法构建诺卡菌菌种系统发育进化树。 2.鼻疽诺卡菌耐药基因gyrA、gyrB突变位点的检测与分析： 选取20株鼻疽诺卡菌，其中环丙沙星耐药菌株和敏感菌株各10株，对其耐药基因gyrA、gyrB的QRDR扩增后测序，采用Mega6.06软件对测序得到的基因序列与GenBank下载的鼻疽诺卡菌标准菌株IFM10152的gyrA、gyrB基因序列进行比对分析。 3.外排泵抑制剂对鼻疽诺卡菌环丙沙星敏感性的影响： 采用微量肉汤稀释法检测上述20株鼻疽诺卡菌，关于环丙沙星及外排泵抑制剂羰基氢氯苯腙、甲硫哒嗪、氯丙嗪的MIC，选取阿尔玛蓝试剂作为显色液。分别在三种泵抑制剂1/2MIC和1/4MIC的浓度条件下，检测20株鼻疽诺卡菌环丙沙星MIC值的变化。 4.鼻疽诺卡菌外排泵基因及孔蛋白基因表达量变化的初步研究： 根据GenBank中已发布的鼻疽诺卡菌标准菌株IFM10152全基因组序列及其注释，选取管家基因secA作为内参基因，选取2个孔蛋白基因nfa15890、nfa49590及23个MFS家族假定药物外排泵基因进行研究。对上述20株菌株进行无环丙沙星和亚抑菌浓度(1/4 MIC)环丙沙星的诱导培养，提取RNA后反转录，并采用RT-PCR检测其表达量变化，采用公式2-ΔΔCT计算待测基因相对表达量差异倍数。 结果： 1. secA1基因用于诺卡菌菌种鉴定分型的研究： 91株受试诺卡菌 secA1基因的种内相似度为97.2％~100%，平均相似度达98.6%；种间相似度为85.2%~98.4%，平均相似度达91.8%。以secA1基因构建的系统发育进化树中，16种诺卡菌被准确分离为16个独立的分支，诺卡菌近缘种新星诺卡菌复合体、少食/短链诺卡菌复合体均可有效分离。 2.鼻疽诺卡菌耐药基因gyrA、gyrB突变位点的检测与分析： 20株鼻疽诺卡菌中，发现有6株gyrA基因在第294位点出现碱基由胞嘧啶到鸟嘌呤（C-G）的点突变，突变率为30%。其中环丙沙星耐药菌株2株，敏感菌株4株，然而突变前后其编码的氨基酸未发生改变，均为精氨酸，属于无义突变。20株鼻疽诺卡菌中，未发现gyrB基因突变位点。 3.外排泵抑制剂对鼻疽诺卡菌环丙沙星敏感性的影响： 泵抑制剂应用之前，20株鼻疽诺卡菌中环丙沙星MIC值8μg/ml的菌株有3株，4μg/ml的菌株有7株，1μg/ml的菌株有2株，0.5μg/ml的菌株有8株；三种泵抑制剂应用之后，环丙沙星 MIC值均降低至小于等于0.125μg/ml，降低倍数在4倍至64倍之间，泵抑制剂应用前后差异有统计学意义。 4.鼻疽诺卡菌外排泵基因表达量变化的初步研究： 与无环丙沙星诱导压力时的外排泵基因表达量相比，在环丙沙星1/4MIC的诱导压力下，耐药菌株中高表达（即相对表达量差异倍数≥4）的外排泵基因有三个，分别为nfa56470、nfa29840、nfa34160，其高表达的菌株数量分别为10株、7株、1株；敏感菌株中未见高表达的外排泵基因。对环丙沙星耐药组与敏感组各外排泵基因相对表达量变化进行两独立样本t检验，具有统计学差异的外排泵基因有8个，分别为 nfa11010（P=0.04）、nfa21830（P=0.03）、nfa25500（P=0.03）、nfa29840（P=0.05）、nfa34160（P=0.02）、nfa38830（P=0.00）、nfa56470（P=0.04）、nfa9390（P=0.04）。 5.鼻疽诺卡菌孔蛋白基因表达量变化的初步研究： 与无环丙沙星诱导压力时的孔蛋白基因表达量相比，在环丙沙星1/4MIC的诱导压力下，耐药菌株与敏感菌株孔蛋白基因的相对表达量均有所降低，但降低倍数均在四倍以下。对环丙沙星耐药组与敏感组孔蛋白基因的相对表达量变化进行两独立样本t检验，P值分别为0.59（nfa15890）和0.68（nfa49590），认为差异无统计学意义。 结论： 1、secA1基因序列分析为诺卡菌菌种的鉴定分型提供了一种新方法，对诺卡菌属可进行较好的鉴定和分型，尤其在诺卡菌近缘种的分型方面有独特的优势。 2、泵抑制剂明显提高了环丙沙星对鼻疽诺卡菌的敏感性，提示外排泵机制参与环丙沙星耐药机制的形成,推测鼻疽诺卡菌膜上主动外排泵的激活是其产生对喹诺酮类抗生素环丙沙星耐药的主要机制。