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研究背景: 线粒体单体型本质上是mtDNA多态性,单体型是指含有某一多态模式的多态性位点的一个集合。由于mtDNA是母系遗传,许多mtDNA单核苷酸多态性(SNPs)在母系遗传中得到积累。有文献报道,线粒体单体型及其特异的SNP位点如m.10398A/G、m.5178C/A和m.16519T/C对许多疾病(如癌症、衰老、糖尿病、骨关节炎、精神分裂症以及遗传性视神经病变)可能是有利的也可能是有害的。在人类细胞的研究中,我们利用胞质融合技术(构建相同核背景下只有线粒体基因不同的细胞模型)。探讨线粒体单体型/ SNPs对线粒体OXPHOS的影响。 目的: 1.筛选并建立东亚主要的线粒体单体型融合细胞,并为以后的转录组学、蛋白组学、代谢组学研究提供细胞基础。 2.比较21株线粒体融合细胞或SNPs的功能。 3.为线粒体单体型与疾病的分子流行病学研究提供依据。 4.为线粒体单体型影响人类退行性疾病的机制研究提供细胞功能方面的依据。 方法: 1.采集健康人的外周血,提取全基因组DNA,利用一代测序技术筛选特定的21个线粒体单体型个体。 2.抽取各单体型个体的外周血,分离血小板,与不含mtDNA的143B rho0细胞融合,构建只有线粒体不同而核背景完全相同的细胞模型。 3.提取所构建的融合细胞模型包含 mtDNA的总 DNA,PCR扩增 mtDNA全序,对比分析融合细胞模型mtDNA全序列。 4.将各单体型细胞模型培养至最佳状态后,检测线粒体OXPHOS的表达水平。 1)使用荧光定量技术检测单体型融合细胞株mtDNA拷贝数水平; 2)使用荧光定量技术检测单体型融合细胞株RNA的表达水平(检测线粒L链、H1链、H2链的表达水平); 3)应用 BN-PAGE的实验方法检测单体型融合细胞株线粒体呼吸链复合体 CI、CII、CIII、CIV、CV含量; 5.将各单体型细胞模型培养至最佳状态后,检测各单体型细胞模型的线粒体功能。 1)Clark氧电极法检测单体型融合细胞株线粒体内源性氧呼吸功能; 2)荧光染料法检测单体型融合细胞株线粒体膜电位水平; 6.利用免疫荧光和激光共聚焦显微镜观察不同线粒体基因遗传背景下线粒体形态。 7.细胞内逆向信号通路的第二信使分子检测。 1)荧光染料法检测单体型融合细胞株基础ROS生成量。 2)应用NAD+/NADH检测试剂盒检测各单体型细胞模型的NAD+/NADH。 8.统计学分析:应用SPSS17.0软件分析。 结果: 1.经测定全序比对后确定所建立的融合细胞株分别为: D4g2、D4j、G3a2、G2a1、D5a2、C7a1、M8a2a、M7b1a1、M7b1a1b、A5c、A13、N9a1、Y1、B4a2b1、B4b1a、B5a、B5b2a、F1a14、F1f、F2、F2e。 2.线粒体单体型M的mtDNA拷贝数水平显著高于线粒体单体型N,P<0.001。 3.线粒体单体型M的L(2.8倍)链和H2(1.42倍)链的表达水平显著高于线粒体单体型N,L链P<0.01,H2链P<0.001。 4.线粒体单体型M的OXPHOS复合体III水平显著高于线粒体单体型N, P<0.05。 5.线粒体单体型M的基础氧呼吸和非偶联氧呼吸均比线粒体单体型N显著升高,P值均小于0.01。 6.线粒体单体型M的膜电位水平显著高于线粒体单体型N,P<0.05。 7.线粒体单体型并不影响单体型M与N的线粒体形态,P>0.05。 8.线粒体单体型M的基础ROS生成比线粒体单体型N低20%,P<0.1。 9.线粒体单体型M的NAD+/NADH比值比线粒体单体型N显著升高,P<0.001。 结论: 1.通过对所构建21个细胞模型进行mtDNA全序列分析证明在我们所构建的单体型融合细胞模型中,我们所开展的线粒体功能检测结果差异仅仅是由不同的mtDNA遗传背景所致。 2.通过对21株细胞的线粒体的内源性氧呼吸、膜电位检测,表明线粒体单体型M的OXPHOS功能相对线粒体单体型N较好 3.通过对21株细胞的mtDNA拷贝数、线粒体基因转录水平以及OXPHOS蛋白的表达量以及第二信使分子检测,表明线粒体单体型可能通过调节线粒体逆向信号通路影响线粒体OXPHOS功能 4.拷贝数分析表明在D-loop区的四个SNP位点m.16162A>G、m.16352T>C、m.204T>C和 m.16297T>C可能高水平影响mtDNA复制,而其它位点的影响较小;m.16162A>和 m.16352T>C线粒体 RNA的表达水平低, m.204T>和Cm.16297T>C线粒体RNA的表达水平高,表明这4个位点影响DNA的复制转录。