目的:吡咯里西啶生物碱（Pyrrolizidine alkaloids,PAs）是一类天然植物毒素,广泛分布在全球6000多种植物中,是引起临床肝窦阻塞综合征（Hepatic sinusoidal obstruction syndrome,HSOS）的主要原因之一。近年来,因误服误用含PAs的中草药及复方所致HSOS的报道逐年增多,引起了国内外的广泛关注。在我国约50.0-88.6%的HSOS病例与误服菊三七（Gynura japonica（Thunb.）Juel.）有关,目前在临床上尚无有效的治疗方法。大量研究表明,PAs对肝窦内皮细胞（Liver sinusoidal endothelial cells,LSEC）的损伤是HSOS发生的起始因素和关键环节,然而目前对PAs损伤LSEC的毒性机制尚未明确。因此,本研究经筛选确认以菊三七主要毒性成分千里光碱（Senecionine,SEN）为代表性PA,进一步探讨其损伤LSEC的毒性机制及靶点。方法:首先评价菊三七总提物（Total extract,TE）、总碱（Total alkaloids,TA）及其主要毒性PAs–SEN和千里光菲林碱（Seneciphylline,SEPH）对小鼠造成的急性肝毒性,主要以小鼠的血清生化指标、肝脏病理切片和毒性标记物吡咯蛋白加合物（Pyrrole–protein adducts,PPA）的含量来评判,并通过电镜扫描肝窦超微结构观察药物对肝窦内皮的损伤。其次以SEN（50 mg/kg）灌胃给药小鼠2 h和12 h后分离LSEC,进行定量蛋白组学（TMT标记）分析,筛选差异蛋白及进行生物信息学分析,并分析验证关键信号分子的基因和蛋白表达水平。此外,还进行了体外实验,采用人肝窦内皮细胞（Human hepatic sinusoidal endothelial cells,HHSEC）,分别通过CCK-8试验和乳糖酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测SEN对细胞存活率及细胞完整性的影响,并检测毒性标志物PPA含量,同时分析SEN对细胞中炎症等信号通路关键信号分子的影响。结果:在小鼠急性肝损伤实验中,菊三七TE、TA及其主要毒性PAs（SEN和SEPH）均引起小鼠肝功能血清指标ALT、AST等的显著性升高,大片出血性肝细胞坏死及肝窦和中央静脉胶原沉积等显著的肝脏病理改变,毒性代谢产物PPA的生成,并导致LSEC上的窗孔堵塞、数量减少等;通过SEN（50 mg/kg）时-毒关系的研究,发现LSEC在给药前期就发生损伤（给药后1 h即可见轻微损伤,给药后2 h极为明显）,早于肝实质细胞发生炎症、凋亡等损伤（给药后12 h可见）。蛋白组学研究表明,SEN显著影响了LSEC的细胞过程和代谢过程,且大多的差异蛋白具有丰富的催化活性;SEN诱导了LSEC的炎症反应,并影响了血小板反应蛋白1（Thrombospondin 1,TSP1）介导的多条通路（包括TSP1结合CD47配体通过Rho-Rho激酶-肌球蛋白途径诱导LSEC中的窗孔损失、抑制NO信号、TSP1激活成纤维活性TGF-β信号通路等）。另外TSP1、CD47、MMP9、TGFB1、TP53等关键信号分子的蛋白表达水平在SEN给药后明显升高。体外研究表明,SEN可显著降低HHSEC的细胞存活率,增加LDH含量;并在细胞中检测到了大量PPA且其含量随给药SEN浓度呈剂量-时间依赖性增加;另外SEN还导致了HHSEC中ICAMI等多种炎症因子的显著性升高,并诱导VEGFA、MMP9、CD47等基因的表达、降低NOS3的表达。结论:菊三七及其主要毒性成分SEN通过代谢活化最先损伤LSEC而导致肝毒性,除炎症反应外,首次发现关键蛋白TSP1及其调控途径在SEN诱导LSEC损伤的重要因素,提示通过阻断TSP1-CD47通路可能是一条潜在治疗PAs导致HSOS的新策略。本研究提供了PAs损伤LSEC的关键信息,不仅拓展了目前对于PAs毒性机制的认识,并为PAs致HSOS的临床治疗提供了新的策略。