【摘 要】
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目的人体羧酸酯酶1（CES1）是重要的丝氨酸蛋白酶家族中的重要成员,在内源性代谢、外源性代谢中发挥重要作用。CES1还是肝脏组织中高表达蛋白质,当组织损伤时,可在血中检测出其明显的升高,是非常特异性的肝脏损伤标志物,根据人体羧酸酯酶1（Carboxylesterase1,CES1）活性腔的特点、底物偏好和催化反应机理,设计一种用于CES1特异性检测的生物发光探针,对探针在体外中药活性成分发现和筛选
【基金项目】
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国家重点研发计划，基于器官芯片技术的中药安全性有效性评价体系（2017YFC1702000）； 国家科技重大专项“重大新药创制”子课题,中药组份配伍成药性评价关键技术（2018ZX09731016）； 国家自然基金面上项目,酯类前体药物再评价与羧酸酯类水解酶作用属性比较的机理研究（81973393）；
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目的人体羧酸酯酶1（CES1）是重要的丝氨酸蛋白酶家族中的重要成员,在内源性代谢、外源性代谢中发挥重要作用。CES1还是肝脏组织中高表达蛋白质,当组织损伤时,可在血中检测出其明显的升高,是非常特异性的肝脏损伤标志物,根据人体羧酸酯酶1（Carboxylesterase1,CES1）活性腔的特点、底物偏好和催化反应机理,设计一种用于CES1特异性检测的生物发光探针,对探针在体外中药活性成分发现和筛选中的应用进行研究。方法（1）通过查阅文献了解CES1的反应机理和底物偏好性,总结CES1现有探针的优缺点,对探针结构与缺点之间的关系进行分析,确定探针结构设计的方向,并确定新探针的结构。（2）根据目的探针结构设计合成路线,合成探针,通过氢谱和碳谱确定预期探针的化合物结构。依次测量新探针产物波长、酶介导下的水解能力、单酶选择性、反应体系抗干扰能力和酶动力学参数。（3）对新探针进行简单的结构衍生,并对探针衍生化合物的化学属性和生物学属性进行评估,进行简单构效关系分析。（4）通过探针体外高通量筛选体系,研究了一批中药成分对CES1的调节作用,探索探针在中药活性成分发现中的应用。结果合成了结构为（S）-2-（6,7-二氢-[4,5-f]吲哚-噻唑基）-4,5-二氢噻唑-4-羧酸甲酯的新型生物发光探针（（S）-2-（6,7-Dihydro-[4,5-f]indole-thiazolyl）-4,5-dihydrothiazole-4-carboxylic acid methyl ester,简称DDM1）,结构为2-（5-甲基-6,7-二氢-5H-噻唑并[4,5-f]吲哚-2-基）-4,5-二氢噻唑-4-羧酸甲酯（2-（5-Methyl-6,7-dihydro-5H-thiazolo[4,5-f]indol-2-yl）-4,5-dihydrothiazole-4-carboxylic acid methyl ester,简称DDM2）,两种探针均具有良好的选择性,抗干扰性,光化学信号输出优于现有探针DME及NLMe。通过筛选五环三萜类化合物,发现了一种具有较好CES1选择性抑制的化合物白桦脂酸,并测试了白桦脂酸细胞层面的抑制,根据抑制强度与结构关系,初步找到五环三萜类化合物对CES1抑制构效关系。结论基于CES1的底物偏好性,在前期研究团队的生物发光探针萤火虫荧光素甲酯衍生物缺陷的基础上,进行四氢吡咯结构衍生,设计合成两种全新的生物发光底物探针DDM1及DDM2;在光学属性、选择性及反应测试体系便捷性等方面,利用包括反应表型等多种评价鉴定技术系统评估了该探针底物的相关属性,并与现有探针进行了对比。DDM1和DDM2在多种属性中均优于已有探针;依据该荧光素酶体系设计的探针在体内整体表征方面,如药物分布、羧酸酯酶在不同动物的各脏器组织间的分布等方面将有非常好的应用前景。研究了中药天然五环三萜类化合物对CES1活性的影响,并对两种类似亚型CES1和CES2的抑制作用构效关系及其规律进行了分析,为中药的相关代谢机制、药物结构衍生优化提供科学研究基础。
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