【摘 要】
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目的:我们在前期研究中已经证实黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)可以防治高脂饮食诱导的小鼠肥胖和非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)。并通过肠道菌群组成分析,证实黄芪多糖可以调节肠道菌群结构。我们进一步利用转录组学筛选出APS改善NAFLD的潜在效应靶标——腺苷受体A1(Adenosine Rec
【基金项目】
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国家自然科学基金(81873059 & 81673662); 上海市教委:东方学者; 曙光学者(16SG36);
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目的:我们在前期研究中已经证实黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)可以防治高脂饮食诱导的小鼠肥胖和非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)。并通过肠道菌群组成分析,证实黄芪多糖可以调节肠道菌群结构。我们进一步利用转录组学筛选出APS改善NAFLD的潜在效应靶标——腺苷受体A1(Adenosine Receptor A1,ADORA1)。我们将在此基础上,探究肠道菌群在APS防治NAFLD中的作用,并进一步明确肠道菌群的改变在APS抑制ADORA1中的作用。方法:1.动物混养实验:将小鼠分为高脂饮食组(HFD)与APS组(APS)分别给予高脂饮食和含有4%APS的高脂饮食,连续喂养12周。在第12周末,将以上两组动物随机分成两个亚组(HFD和HFD_Co H;APS和APS_Co H),并分别将HFD_Co H亚组和APS_Co H亚组共10只动物进行标记后混于一笼饲养,剩余2个亚组动物各自单独饲养作为对照,给予高脂饮食再连续饲养8周。检测小鼠体重、能量摄入、统计肝脂肪变性指数、肝脏HE染色、检测血清谷丙转氨酶(ALT)水平和肝脏甘油三酯(TG)水平。取盲肠内容物进行微生物多样性分析。2.取APS干预2天及2周的小鼠粪便样本进行微生物多样性分析;取正常饮食组(Con)、高脂饮食组(HFD)、APS干预组(APS)连续干预16周后的盲肠内容物进行宏基因组测序,分析肠道菌群结构与功能,筛选差异细菌。3.在宏基因组中筛选短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)产生菌;检测Con组、HFD组和APS组3组血清和粪便样本中SCFAs的含量;检测混养实验中4组血清样本的SCFAs的含量;设计APS体外转化实验,将对照小鼠和万古霉素干预(500 mg/L饮水给药5天)小鼠的盲肠内容物进行体外培养,分别加入200 mg/L APS,检测菌液上清中SCFAs的含量。4.设计乙酸干预实验,将小鼠分为正常饮食组(Con),高脂饮食组(HFD),乙酸干预组(AA),前8周HFD组和AA组都给予高脂饮食,后8周,分别给与高脂饮食和含3.7%乙酸钠的高脂饮食。检测小鼠体重、附睾脂肪重量、肥胖指数、肝脂肪变性指数,肝脏HE染色,检测血清ALT水平和肝脏TG水平,检测脂质相关蛋白的表达。5.检测Con组、HFD组和APS组3组SCFA受体Gpr41和Gpr43基因在不同组织的表达;检测乙酸干预实验中小鼠肝脏ADORA1的表达;以500 mg/kg的给药剂量腹腔注射乙酸钠后在第15和30 min时收集小鼠组织,检测小鼠肝脏ADORA1的表达;以0.25 m M乙酸钠干预小鼠肝原代细胞,检测ADORA1的表达;以1μM乙酸钠干预Adora1启动子质粒转染的AML-12细胞,检测下游荧光表达。结果:1.混养实验证实APS的NAFLD防治作用可以随着肠道菌群的转移而转移;宏基因组的菌群结构和功能分析显示高脂喂养会引发小鼠肠道菌群结构和功能的改变,而APS可以逆转这些变化,这可能与其发挥代谢改善作用密切相关;我们通过双重筛选条件(FC≥2或≤0.5,p<0.01)筛选出了188种差异细菌,其中74种被HFD显著下调,并被APS显著上调,其他114种细菌则呈现相反的变化趋势。2.我们通过宏基因组分析找到了27种SCFAs生成菌,其中18种被高脂饮食显著下调,6种被显著上调;而在APS干预下,7种细菌的丰度被显著回调;通过靶向代谢组学检测了动物体内SCFAs的含量,结果证实APS可以显著上调高脂喂养小鼠血清和粪便中乙酸的含量;体外转化实验证实APS可以被高脂喂养小鼠盲肠的肠道菌群代谢产生大量乙酸,而经抗生素干预后的肠道菌群并没有这种作用,提示我们APS代谢产生乙酸需要肠道菌群的参与。3.乙酸干预动物实验结果表明乙酸干预可以显著降低高脂饮食导致的体重、附睾脂肪质量和指数增加,降低肝脂肪变性程度,血清ALT水平,肝脏TG水平,并降低了肝脏FAS蛋白的表达。4.乙酸干预8周可抑制高脂喂养小鼠肝脏Adora1基因的表达;短期腹腔注射乙酸可以抑制小鼠肝脏ADORA1蛋白的表达;体外实验证实乙酸干预可以显著下调小鼠肝原代细胞ADORA1基因和蛋白表达;在AML-12细胞中证实乙酸干预可以部分抑制Adora1启动子的活性。结论:1.APS对高脂喂养小鼠的NAFLD防治作用具有菌群依赖性。2.APS可以通过调节SCFAs生成菌来代谢产生SCFAs,尤其是乙酸。3.乙酸可以抑制高脂饮食导致的NAFLD,并抑制脂质生成。4.乙酸可以抑制肝脏Adora1基因的转录。
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