研究背景:非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除了酒精、药物和病毒等明确的肝脏损伤因素以外,发生的以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征。NAFLD不仅会显著增加肝脏相关疾病的发病率和死亡率,还与多种肝外疾病的发生发展密切相关。MicroRNAs（miRNAs）主要分布在细胞的胞浆及多个亚细胞器中,具有明显的区域性分布的特征,这对维持细胞的正常功能具有重要作用。然而,人们对细胞内miRNAs区域化分布的机制及其病理和生理意义仍知之甚少。大量研究表明miRNAs是肝脏脂质代谢调控的重要调节者,多种miRNAs在NAFLD相关的代谢紊乱中发挥关键作用。线粒体是肝细胞中最丰富的细胞器之一,线粒体内有大量由细胞核编码的miRNAs,这些miRNAs能从线粒体进入胞浆,调节其细胞核编码的靶基因和下游分子进而调节细胞功能。例如,主要分布在线粒体中的miR-29可以通过抑制胞浆中靶基因PPARGC1A和ABHD5的表达调节肝细胞的脂质代谢。因此,我们推测miRNAs的线粒体-胞浆分布异常可能在NAFLD的发生发展中发挥重要作用。然而,miRNAs在线粒体与胞浆之间的分布在NAFLD中有何异常,这些异常在肝脏脂质代谢和NAFLD发病中有何作用和机制等问题,人们仍一无所知。研究目的:1、确定NAFLD发病中线粒体-胞浆分布显著改变的miRNAs。2、以线粒体-胞浆分布变化最显著的高丰度miRNAs为代表,揭示miRNAs线粒体-胞浆重分布在NAFLD肝脏脂代谢异常中的作用及其机制。研究方法:1、动物分组及造模4周龄雄性SD大鼠,随机分为两组,分别喂以普通饲料和高脂饲料（51%脂肪）12周造模。在此过程中,进行大鼠肝脏的超声检查,并称重大鼠及其肝脏,计算肝指数。用自动生物化学分析仪测定各组大鼠血清中的甘油三酯（Triglycerides,TG）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、谷丙转氨酶（Alanine transaminase,ALT）和谷草转氨酶（Aspartate transaminase,AST）的水平。2、肝脏样本收集及线粒体纯化喂养12周后,处死大鼠,快速取下肝脏,剪碎后使用预冷的RSB低渗缓冲液重悬并研磨肝脏组织,利用差速离心法离心后获得纯化的线粒体。3、miRNAs的纯化和测序按照miRNAs分离纯化试剂盒的说明书分离纯化肝脏细胞及其线粒体的miRNAs,然后利用illumine TruSeq Small RNA Library Prep Kit建立文库,并用SE50模式进行miRNAs 测序。4、miRNAs测序数据分析两组分别送5个样本进行测序。首先,用fastp处理原始测序数据,得到clean data,用bowtie软件将clean data与大鼠基因组进行对比,并将命中的reads与miRNAs序列数据库进行对比,获得miRNAs的注释结果及表达矩阵。然后使用Deseq2比较正常和NAFLD大鼠肝脏及线粒体miRNAs的表达差异。利用mirDIP4.1预测线粒体-胞浆分布异常的典型miRNAs的靶基因,并选择由3个不用软件共同预测到的靶基因进行功能富集分析和调控网络分析,同时使用Cytoscape3.9.1的MCODE插件进行核心子网络分析。5、细胞培养与处理使用完全培养基培养HepG2和HEK293T细胞。将HepG2细胞随机分组,分别使用不同浓度的油酸（Oleic acid,OA）和棕榈酸（Palmitic acid,PA）刺激24h或48h,构建NAFLD的细胞模型。HEK293T细胞主要用于双荧光素酶实验。6、用miRNAs及其靶基因/下游信号分子的表达载体共转染肝细胞HepG2细胞生长至60%融合后,用Opti-MEM培养基按比例稀释RNAiMAX和siRNA后转染miRNAs的模拟物或抑制物,转染6小时后换液。用Opti-MEM培养基分别按比例稀释Lipofectamine 3000和表达载体以及P3000转染相应靶基因/下游信号分子的表达载体,6小时后换液,再培养36-48小时。7、双荧光素酶报告基因实验分别构建含靶基因3’UTR上相应miRNAs结合位点序列、以及相应突变序列的pmirGLO荧光素酶载体,然后将构建好的载体分别与miRNAs模拟物或阴性对照序列共转染HEK293T细胞,48小时后检测各组细胞荧光素酶的活性。8、肝细胞脂代谢相关指标和关键信号分子的检测按照qPCR试剂盒的说明书进行qPCR实验,检测各miRNAs及其靶基因和下游脂代谢相关关键基因在mRNA水平的表达,并利用标准曲线法进行绝对定量。裂解HepG2细胞并提取总蛋白,利用Western blotting检测miRNAs的靶基因和下游脂代谢相关关键基因在蛋白水平的表达,使用ImageJ软件对Western blotting结果进行光密度测量和分析。将肝细胞和肝脏组织用4%多聚甲醛固定,然后用油红O溶液进行染色,在显微镜下观察细胞及组织中的脂质沉积。9、统计分析用GraphPad Prism 9.0和R软件包进行统计分析。用Shapiro-Wilk检验判断数据是否符合正态分布。符合正态分布的连续数值数据用平均值±标准差（x±s）表示,用双尾t检验对两组数据进行比较,用单因素方差分析进行多组间比较。非正态分布的数值数据使用Wilcoxon秩和检验进行两组间比较,用Kruskal-Wallis检验进行多组间比较。p＜0.05或调整后的p＜0.05表示具有统计学意义。所有实验都至少独立重复三次。研究结果:1、高脂饮食能诱导SD大鼠发生NAFLD高脂饮食能显著增加SD大鼠的体重,使大鼠肝脏脂质明显堆积,肝指数增高,血清中甘油三酯水平显著增加,诱导大鼠发生NAFLD。2、NAFLD大鼠肝脏多种miRNAs在线粒体中的水平显著改变,但它们在整个肝细胞中的表达水平不变miRNAs的测序结果表明,与正常对照组的大鼠相比,NAFLD大鼠肝脏中有49个miRNAs在整个细胞中的表达水平没有显著变化,但它们的相对线粒体丰度（Rm/t,miRNAs在线粒体中的表达水平与其在整个细胞中的表达水平的比值）显著改变,即它们的线粒体-胞浆分布显著异常。在这些miRNAs中,有48个miRNAs的Rm/t显著降低,即明显向细胞浆转运;只有miR-33-3p的Rm/t显著增加,即明显向线粒体转运。在此基础上,我们进一步利用绝对定量PCR对线粒体-胞浆分布变化最显著的部分miRNAs进行了验证。结果表明 miR-30e-3p、miR-30c-2-3p、miR-339-5p、miR-194-3p、miR-125a-5p、miR-125b-5p和miR-92a-3p这7个miRNAs在线粒体中的分布显著减少,明显向胞浆转运;而miR-33-3p在线粒体中的分布显著增加,即明显向线粒体转运。3、明显从线粒体向胞浆转运的miRNAs的潜在靶基因与肝脏脂代谢密切相关使用mirDIP4.1数据库预测在NAFLD大鼠肝细胞中的总表达量不变,但在线粒体中的水平显著下降,即明显从线粒体向胞浆转运的miRNAs的潜在靶基因,并筛选由3个不同软件共同预测的靶基因,然后对这些潜在靶基因进行功能富集分析。结果表明,这些线粒体-胞浆分布显著改变的miRNAs的潜在靶基因与肝脏脂质代谢相关的多个重要生物过程和信号通路显著富集,如脂质的生物合成、代谢、储存,SREBP信号通路及MAPK信号通路等。4、线粒体-胞浆分布变化显著的 miR-30e-3p、miR-30c-2-3p、miR-339-5p 和 miR-194-3p分别靶向并抑制肝细胞TBL1XR1、PDK2、OGT和ACLY的表达为进一步探索miRNAs线粒体-胞浆重分布在NAFLD发生发展中的作用和机制,我们以线粒体-胞浆分布变化最显著的高丰度的miR-30e-3p、miR-30c-2-3p、miR-339-5p和miR-194-3p为重点,研究了它们对肝细胞脂代谢的影响及其机制。结果表明棕榈酸及油酸能显著下调HepG2细胞线粒体中miR-30e-3p、miR-30c-2-3p、miR-339-5p和miR-194-3p的水平,而显著增加它们在胞浆中的水平,但这些miRNAs在细胞中的总表达量并没有明显改变,即这4种miRNAs发生了从线粒体到胞浆的明显转运/重分布。通过qPCR,Western blotting 和双荧光素酶实验,我们证明 miR-30e-3p、miR-30c-2-3p、miR-339-5p和miR-194-3p分别靶向抑制细胞核编码的TBL1XR1、PDK2、OGT和ACLY基因在HepG2细胞的表达。5、miR-30e-3p、miR-30c-2-3p、miR-339-5p 和 miR-194-3p 通过其靶基因协同上调SREBP1-C的表达,从而促进肝细胞的脂质积累为进一步明确 miR-30e-3p、miR-30c-2-3p、miR-339-5p 和 miR-194-3p 在肝脏脂代谢异常中的作用,我们分别将它们的类似物和/或它们靶基因的表达载体共转染HepG2细胞。然后在游离脂肪酸（FFA）刺激的条件下,利用油红O染色检测不同处理的细胞中脂质聚积情况的变化。结果表明上述4个miRNAs能通过它们的靶基因促进HepG2细胞的脂质积累。有研究提示上述4个miRNAs的靶基因TBL1XR1、PDK2、OGT和ACLY能调控在脂代谢中发挥关键作用的基因SREBP1-C的表达。而且,我们的结果也表明NAFLD大鼠肝脏中SREBP1-C的表达也显著增加。据此,我们进行了进一步的功能研究,结果表明上述4个miRNAs确实能通过其靶基因显著上调肝细胞中SREBP1-C的表达,促进肝细胞的脂质积聚。研究结论:1、NAFLD大鼠肝脏中有多个miRNAs的总表达量不变,但在线粒体和细胞浆之间的分布显著改变,而且这些miRNAs与肝细胞的脂质代谢功能关系密切。2、NAFLD大鼠肝脏中线粒体-胞浆分布变化最显著的高丰度的miR-30e-3p、miR-30c-2-3p、miR-339-5p和miR-194-3p明显向胞浆转运,分别靶向抑制细胞核编码的TBL1XR1、PDK2、OGT和ACLY基因的表达。3、miR-30e-3p、miR-30c-2-3p、miR-339-5p 和 miR-194-3p 通过它们的靶基因协同上调SREBP1-C的表达,从而促进肝细胞的脂质积聚。