目前一些养殖企业将镇静催眠类药物如地西泮添加于家禽或家畜的饲料和饮水中，造成动物性食品中此类药物的高残留，严重影响了消费者的健康。这些有害物质一般具有不易察觉、检测难度大、危害严重等特点，所以目前针对饲料或饮水中地西泮及其代谢产物残留的检测成为饲料检测及其监督部门最棘手的问题之一，因此建立快速、有效的检测地西泮残留的方法显得十分重要和紧迫。本实验以镇静催眠类药物地西泮为主要研究对象，通过抗体复筛技术制备出高特异性、高灵敏度的抗体，然后将所制备的抗体用于压电石英晶体微天传感器中，研制出了一种可以实现地西泮残留检测的压电免疫传感器。　　本研究的主要目的是利用复筛技术制备高特异性、高灵敏度抗体，将其应用于石英晶体微天平中，构建一种用于地西泮残留检测的压电免疫传感技术。研究的主要内容有以下三个方面:　　（一）地西泮单克隆抗体的复筛　　目前针对地西泮的检测基本上以免疫学检测方法为主，免疫学检测主要是基于抗原和抗体的特异性识别作用，因此抗体的特异性高低直接影响着检测结果。本实验在已有阳性杂交瘤细胞株的基础上进行进一步复筛，明显提高了地西泮单克隆抗体的检测灵敏度。　　复筛过程中主要利用有限稀释亚克隆方法对阳性杂交瘤细胞株进行亚克隆，亚克隆以后随时观察细胞的生长状态并且及时记录单细胞株。当观察到有单株细胞出现时要及时换液并且利用酶联免疫吸附方法(ELISA)对细胞上清进行鉴定，经过一系列筛选最终得到了一株特异性良好的单细胞株命名为C8B1C8。　　（二）地西泮单克隆抗体的性质鉴定及其ELISA方法的初步建立。　　实验中采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。首先将高压灭菌后的石蜡油注入小鼠腹腔中，7-10天以后将筛选得到的单细胞株注入小鼠腹腔，这时杂交瘤细胞株在小鼠腹腔中生长并且有腹水产生，待小鼠腹部明显隆起以后取小鼠腹水即可得到腹水型单克隆抗体。首先将得到的腹水型单克隆抗体利用过滤离心法进行预处理，接着利用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水型单克隆抗体进行进一步纯化。纯化效果利用SDS-PAGE法进行鉴定，从凝胶电泳图中可以看出腹水型单克隆抗体经过纯化以后杂蛋白被有效地去除，得到了纯度比较高的单克隆抗体。接着对单克隆抗体的性质进行一系列的鉴定，主要包括以下几个方面:　　1)利用抗体亚型鉴定试剂盒对单克隆抗体亚型进行鉴定:经过鉴定得抗体的亚型为IgG1型。　　2)单克隆抗体浓度的确定:利用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度为5mg/mL。　　3)单克隆抗体亲和力常数的测定:抗原与抗体之间亲和力的大小一般以抗体平衡解离常数(KD)来表示。实验中采用表面等离子体测定仪(SPR)来测定抗体平衡解离常数，经过数据拟合最终得KD=4.09×10-7M　　4)单克隆抗体特异性测定:实验中选取6种地西泮的结构类似物进行交叉反应率的测定，包括氟西泮、硝西泮、劳拉西泮、替马西泮、奥沙西泮、氯硝西泮，复筛后所得的抗体与大多数结构类似物没有明显的交叉反应率，即抗体特异性良好。　　5)间接竞争ELISA方法的初步建立:首先利用棋盘滴定方法确定最佳的包被原浓度和最佳的抗体稀释倍数，在已经优化出来浓度的基础之上建立ELISA标准曲线，抗体的回归方程为y=31.85LogC+112.81 R2=0.9849，复筛后抗体的IC50=10.80ng/mL，检测范围为0.45-862ng/mL(IC10-IC90)，与复筛前相比灵敏度提高了5倍(复筛前抗体的IC50=60.80ng/mL)，即复筛效果比较明显。　　6)实际样品加标回收实验:实验中用猪肉进行加标回收来模拟实际样品检测，得加标回收率78.33-96.11％。　　（三）基于磁纳米颗粒信号放大免疫传感技术研究　　1)地西泮单克隆抗体与磁纳米颗粒的偶联及其偶联条件的优化。　　实验中首先需要将地西泮单克隆抗体与磁纳米颗粒进行偶联，然后将这种偶联物用于压电免疫传感器中。实验中利用酶联免疫吸附法(ELISA)对磁纳米颗粒的浓度和单克隆抗体的浓度进行优化，得最佳磁珠浓度和单克隆抗体浓度分别为1mg/mL和10μg/mL。　　2.基于磁纳米颗粒信号放大免疫传感技术的研究。　　首先在金电极表面组装上一层十一巯基十一烷酸单分子膜，经过EDC/NHS活化以后可以将地西泮包被原包被在金电极的表面，然后将所制备的磁纳米颗粒-抗体偶联物与游离地西泮抗原一同加入到已经包被好的金电极表面，金片表面的抗原与游离的抗原就会竞争性结合磁纳米颗粒-抗体偶联物，当游离的抗原浓度比较高的时候，竞争抑制效果比较明显，传感器的频率改变比较低，反之则会比较高。频率改变与游离抗原的浓度在一定范围内成线性关系，据此我们建立了一种基于磁纳米颗粒信号放大的压电免疫传感检测技术。　　实验中也对实验条件进行了一系列的优化，主要包括:　　1)实验中采用正交实验的方法确定最佳的包被浓度和包被时间，最终得最佳包被浓度为2mg/mL，最佳的包被时间为120min。　　2)实验采用正交实验的方法确定最佳磁珠-抗体浓度和最佳磁珠抗体孵育时间，最终得最佳磁珠抗体浓度为2mg/mL，最佳孵育时间为40min。　　3.在已经优化出来的实验条件基础之上，建立标准曲线，最终所建立的检测方法的检测范围为8-500ng/mL，最低检测限为0.8ng/mL。　　4.实验中选取4种地西泮的结构类似物进行交叉反应实验，最终证明所建立的方法对地西泮的特异性良好。