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目的:在全球范围内,肝癌是第二大最常见的癌症死亡原因,每年导致超过700,000例死亡,它是一种侵袭性的恶性肿瘤,通常预后较差,五年生存率估计低于9%。作为重要的表观遗传调控机制,组蛋白甲基化在许多生物学过程中都起着重要作用,与视网膜母细胞瘤蛋白相互作用的锌指蛋白1（retinoblastoma protein-interacting zinc finger gene1,RIZ1）是一种甲基转移酶,RIZ1能使组蛋白的H3K9甲基化成H3K9me1。长非编码RNA（lnc RNA）是一组长度大于200个核苷酸的非蛋白质编码RNA。越来越多的证据表明,可能作为癌基因或抑癌基因的lnc RNA在人类疾病的病理生理中,尤其是在肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用。但是,Lnc RNA在肝癌中的调控机制尚未完全阐明。鉴于此,本研究目的是探讨组蛋白甲基转移酶RIZ1是否可以介导lnc RNA HOTAIRM1启动子上的H3K9me1富集,通过靶向mi R-125b来调节肝细胞癌的生长和转移。研究其表达改变的情况及其可能发生的分子机制,进而从一个新的角度阐述RIZ1和Lnc RNA HOTAIRM1在肝细胞癌中发挥作用的机制。研究方法:1.研究RIZ1与lnc RNA HOTAIRM1在肝细胞癌中的表达及其临床意义（1）利用TCGA数据库和GEPIA数据库分析RIZ1与lnc RNA HOTAIRM1在肝细胞癌组织表达水平及其临床意义。（2）采用q RT-PCR检测本科室收集的肝细胞癌患者组织样本、血液样本及细胞培养中RIZ1和HOTAIRM1表达情况及其临床意义。（3）Western Blot和免疫组织化学染色方法测定肝细胞癌患者组织样本中RIZ1蛋白表达水平。2.研究组蛋白甲基转移酶RIZ1介导的HOTAIRM1启动子上的H3K9me1富集对肝细胞癌细胞生物学行为的影响（1）构建RIZ1和HOTAIRM1干扰慢病毒:LV-RIZ1-RNAi（97334-1）,LV-RIZ1-RNAi（97335-1）,LV-RIZ1-RNAi（97336-1）;L V-HOTAIRM1-RNAi（97354-1）,LV-HOTAIRM1-RNAi（97355-1）,LV-HOTAIRM1-RNAi（97356-1）;及阴性对照病毒:KLLVCONO77（hu6-MCS-ubiquitin-EGFP-IRES-puro mycin）;HOTAIRM1过表达慢病毒:LV-HOTAIRM1（65150-1）,阴性对照病毒为C ON238（ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-pur-omycin）,摸索出慢病毒对肝细胞癌细胞感染的MOI和最佳感染条件。（2）用LV-RIZ1-RNAi慢病毒转染肝细胞癌细胞后,研究RIZ1干扰后对肝细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响;利用PI染色法检测干扰RIZ1后对肝细胞癌细胞周期的影响;通过Annexin V-PE染色法检测RIZ1干扰后对肝细胞癌细胞凋亡的影响。（3）我们采用染色质免疫沉淀（Ch IP）实验分析评估H3K9me1与HOTAIRM1启动子的结合。（4）采用Western Blot方法测定LV-RIZ1-RN Ai慢病毒转染后,肝细胞癌细胞中的H3K9me1表达情况;用q RT-PCR方法检测转染LV-RIZ1-RNAi慢病毒后肝细胞癌细胞HOTAIRM1的表达水平。（5）用LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1-RNAi或LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1共转染肝细胞癌细胞,分析肝细胞癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡的情况。3.研究lnc RNA HOTAI RM1与mi R-125b相互作用对肝细胞癌生物学行为的影响及其临床意义。（1）运用生物信息学软件预测lnc RNA HOTAIRM1的靶向mi RNA。（2）通过双荧光素酶报告基因实验,验证HOTAIRM1是否可以直接结合mi R-125b,我们构建了HOTAIR M1-wt荧光素酶报告基因载体和HOTAIRM1-mut 3’-UTR荧光素酶报告基因载体,并进行荧光素酶报告基因分析。（3）通过q RT-PCR测定用LV-HOTAIRM1-RNAi或LV-HOTAIRM1慢病毒转染肝细胞癌细胞后mi R-125b的表达水平。（4）用LV-RIZ1-RNAi慢病毒转染后,通过q RT-PCR测定mi R-125b在肝细胞癌细胞中的表达水平。（5）为了研究mi R-125b对肝细胞癌细胞生物学行为的影响,我们构建了LV-hsamir-125b-1慢病毒。（6）将慢病毒LV-hsa-mir-125b-1或LV-HOTAIRM1+LV-hsa-mir-125b-1或LV-HOTAIRM1-RNAi+LV-hsa-mir-125b-1转染肝细胞癌细胞后,分析肝细胞癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡情况。（7）通过q RT-PCR检测我们收集的肝细胞癌患者组织样本、血液样本及肝细胞系中mi R-125b的表达情况。结果:1.（1）利用TCGA数据库和GEPIA数据库对肝细胞癌患者组织中的RI Z1与lnc RNA HOTAIRM1表达水平进行分析。通过分析可以看出在肝细胞癌患者癌组织中,RIZ1的表达升高而HOTAIRM1的表达下降;分析发现RIZ1的表达与年龄和TNM分期无关,与性别有关,女性肝细胞癌患者癌组织样本中RIZ1的表达比男性高;Kaplan-Meier分析表明,RIZ1的高表达与总生存期降低有关;HOTAIR M1的表达量与肝细胞癌的Stage分级没有明显的差异;Kaplan-Meier分析表明,肝细胞癌患者HOTAIRM1的高表达与总生存期延长没有明显的差异。（2）实时荧光定量PCR检测结果显示:在肝细胞癌患者组织样本中,癌组织中RIZ1高表达;肝细胞癌患者血液样本中RIZ1表达量比正常患者的表达量高;HCC-LM3、HEPG2、LO2肝细胞系中,HCC-LM3细胞中RIZ1高表达。在肝细胞癌患者组织样本中,正常组织中HOTAIRM1高表达;肝细胞癌患者血液样本中HOTAIRM1表达量比正常患者的表达量低;HCC-LM3、HEGP2、LO2肝细胞系中,LO2细胞中HOTAIRM1高表达。（3）Western Blot和免疫组织化学染色方法测定结果显示RIZ1在肝细胞癌患者癌组织中是高表达的。（4）分析发现RIZ1和HOTAIRM1的表达情况与患者肿瘤大小及肿瘤数量密切相关,但其与患者年龄、性别、乙肝、肝硬化、AFP、门静脉癌栓、肿瘤分化程度及TNM分期等因素无关。2.（1）LV-RIZ1-RNAi慢病毒转染HEPG2的最佳感染条件为,LV-RIZ1-RNAi（97336-1）慢病毒+Hi Trans G P组,MO I=10;LV-RIZ1-RNAi慢病毒转染HCC-LM3的最佳感染条件为,LV-RIZ1-RNAi（97334-1）慢病毒+Hi Trans G P组,MOI=20;LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1-RNAi共转染HEPG2,最佳感染条件为,LV-RIZ1-RNAi（97336-1）+LV-HOTAIRM1-RNAi（97355-1）慢病毒+Hi Trans G A组,MOI=10;LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1共转染H CC-LM3的最佳感染条件为,LV-RIZ1-RNAi（97334-1）+LV-HOTAIRM1（65150-1）慢病毒+Hi Trans G P组,MOI=20。（2）Ch IP分析可评估H3K9me1与HOTAIRM1启动子的结合,并且我们观察到HEPG2和HCC-LM3细胞中H3K9me1与HOTAIRM1启动子之间的结合增加。（3）Western Blot方法测定结果显示,LV-RIZ1-RNAi慢病毒转染后,HEPG2和HCC-LM3细胞中的H3K9me1表达受到抑制。（4）用LV-RI Z1-RNAi慢病毒转染后,对HEPG2和HCC-LM3细胞进行分析,结果表明,与对照组相比,抑制RIZ1的表达降低了HEPG2和HCC-LM3细胞的增殖、侵袭、和迁移,增加了细胞的凋亡;细胞周期分析结果表明,对RIZ1的抑制增加了HEPG2和HCC-LM3 S期细胞的比例,结合细胞增殖实验结果,说明RIZ1干扰之后可促进肝细胞癌停滞与S期。（5）LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1-RNAi慢病毒共转染HEP G2细胞,HEPG2细胞中RIZ1的下调表达和HOTAIRM1抑制的共同作用可逆转R IZ1沉默对肝细胞癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡。（6）LV-RIZ1-RNAi+LV-HOT AIRM1共转染HCC-LM3细胞,RIZ1抑制和HOTAIRM1过度表达共同作用进一步抑制了HCC-LM3的细胞增殖、侵袭和迁移,增强了细胞的凋亡。3.（1）我们使用Star Base 2.0数据库预测HOTAIRM1的靶mi RNA,发现mi R-125b是HOTAIRM1的靶mi RNA。（2）我们构建了HOTAIRM1-wt荧光素酶报告基因载体和HOTAIRM1-mut3’UTR荧光素酶报告基因载体,并进行了荧光素酶报告基因分析。结果表明,mi R-125b过表达导致HOTAIRM1-WT的荧光素酶活性显着降低,而HOTAIRM1-MUT则没有。这些结果表明,HOTAIRM1可以直接结合mi R-125b。（3）用LV-H OTAIRM1-RNAi或LV-HOTAIRM1慢病毒转染HEPG2细胞和HCC-LM3细胞。结果表明,HOTAIRM1的过表达显着抑制了mi R-125b的表达,而HOTAIRM1的下调则反向支持了肝癌细胞中mi R-125b的表达。（4）用LV-RIZ1-RNAi慢病毒转染H EPG2和HCC-LM3细胞,结果表明,RIZ1的沉默抑制了HEPG2和HCC-LM3细胞中mi R-125b的表达水平。（5）用LV-HOTAIRM1-RNAi或LV-HOTAIRM1-RNAi+L V-hsa-mir-125b-1慢病毒转染HEPG2细胞,HOTAIRM1在HEPG2细胞中的下调表达,促进了细胞增殖,侵袭和迁移;抑制了细胞的凋亡。和mi R-125b过表达共同作用进一步促进了HEPG2细胞增殖、侵袭和迁移,抑制了细胞的凋亡。（6）用L V-HOTAIRM1或LV-HOTAIRM1+LV-hsa-mir-125b-1慢病毒转染HCC-LM3细胞,结果表明,HOTAIRM1的过表达抑制了HCC-LM3细胞的增殖、侵袭和迁移,促进了细胞的凋亡,并且完全逆转了过表达HOTAIRM1和mi R-125b的共转染结果。（7）肝细胞癌患者癌组织及血液样本中mi R-125b高表达,细胞培养样本HCC-LM3细胞中mi R-125b高表达。（8）分析发现mi R-125b的表达情况与患者乙肝、肿瘤大小及肿瘤数量密切相关,与患者年龄、性别、肝硬化、AFP、门静脉癌栓、肿瘤分化程度及TNM分期等因素无关。结论:1.通过TCGA和GEPIA数据库结合我们收集的样本进行分析,结果表明肝细胞癌患者的组织和血液样本中RIZ1表达水平上调,而HOTAIRM1的表达下调。肝细胞系中,HCC-LM3细胞中RIZ1高表达,LO2细胞中HOTAIRM1高表达。2.Kaplan—Meier生存曲线分析表明RIZ1的高表达与总生存期降低有关,HOTAIRM1的高表达与肝细胞癌患者总生存期延长没有明显的差异。3.RIZ1和HOTAIRM1的表达情况与患者肿瘤大小及肿瘤数量密切相关,即RIZ1高表达与RIZ1低表达的肝细胞癌组织相比,其肿瘤体积相对较大,肿瘤数目相对较多;HOTAIRM1高表达与HOTAIRM1低表达的肝细胞癌组织相比,其肿瘤体积相对较小,肿瘤数目相对较少。4.肝细胞癌细胞中H3K9me1与HOTAIRM1启动子之间的结合增加;RIZ1的下调可以有效抑制肝细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移,增强细胞凋亡;再和HOTAIRM1过表达共同作用后进一步抑制了肝细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移,增强了细胞的凋亡;再和HOTAIRM1抑制共同作用后可逆转RIZ1下调对肝细胞癌细胞的增殖、侵袭、迁移、和凋亡;说明组蛋白甲基转移酶RIZ1可以介导H3K9me1在HOTAIRM1启动子上的富集,从而调节了肝细胞癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡。5.生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验证明mi R-125b可通过直接结合与HOTAIRM1相互作用。mi R-125b在肝细胞癌患者癌组织及血液样本中高表达,在HCC-LM3细胞培养样本中高表达。HOTAIRM1在HEPG2细胞中的下调表达,促进了细胞增殖,侵袭和迁移,抑制了细胞的凋亡。和mi R-125b过表达共同作用进一步促进了HEPG2细胞增殖、侵袭和迁移,抑制细胞的凋亡。HOTAIRM1的过表达抑制了HCC-LM3细胞的增殖、侵袭和迁移,促进了细胞的凋亡,并且完全逆转了过表达HOTAIRM1和mi R-125b的共转染结果。mi R-125b的表达情况与患者乙肝、肿瘤大小及肿瘤数量密切相关,即mi R-125b高表达的肝细胞癌组织与mi R-125b低表达的肝细胞癌组织相比,其肿瘤体积相对较大,肿瘤数目相对较多;乙肝阳性患者中mi R-125b高表达的多,乙肝阴性患者中mi R-125b低表达的多。6.总之我们研究发现组蛋白甲基转移酶RIZ1可以介导lnc RNA HOTAIRM1启动子上的H3K9me1富集,并通过靶向mi R-125b来调节肝细胞癌的生长和转移,这可以进一步影响肝细胞癌的发生和发展。从而为肝癌的治疗提供新的靶标和思路。