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伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）也称为Aujeszky病病毒（Aujeszky’s disease virus,ADV）,属于疱疹病毒科,α-疱疹病毒亚科,水痘病毒属。由该病毒引起的猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）主要表现为猪呼吸道症状、神经症状和繁殖障碍等症状。猪是PRV的储存宿主,也是PRV最重要的传染源之一,该病给我国养猪业造成了巨大的经济损失。PRV具有疱疹病毒的神经嗜性及潜伏感染等特征。PRV感染仔猪后死亡率高达100%,而成年猪感染后一般不产生明显的临床症状或临床症状较为轻微,多数病例呈一过性反应,但康复后PRV不会在体内完全清除并常潜伏在成年猪三叉神经节（Trigeminal ganglion,TG）内,感染猪体内终身带毒且会不断向外界排放,导致其它猪被传染。控制和净化猪伪狂犬病是当今研究的热点。PRV感染细胞后对NF-κB信号通路的影响有一定研究,但对PRV感染三叉神经节细胞所诱导的NF-κB信号通路变化机制和调控炎症因子分泌的机制未见报道。为探究这一科学问题,本试验以小鼠三叉神经节（TG）原代细胞为体外模型,以小鼠为体内模型,从体外和体内两个方面探究PRV感染TG细胞所诱导的NF-κB信号通路变化机制和调控炎症因子分泌的机制,为揭示PRV感染三叉神经节的致病机理提供线索。本试验相关研究内容如下:1.PRV感染TG原代细胞对NF-κB信号通路和炎症因子分泌的影响根据实验室前期研究以及相关文献,首先对小鼠TG原代细胞的培养方式进行优化,主要优化多聚-D-赖氨酸铺板后六孔板晾干方式,由原来置于超净工作台中风干或置于工作台内过夜晾干,更改为将六孔板盖上板盖置于细胞培养箱中烘干,采用该方法培养的原代TG细胞状态较好。成功培养小鼠TG原代细胞后,采用PCR检测TG细胞中FOX3基因转录情况和免疫荧光检测TG细胞中神经元核心抗原（neuronal unclearantigen,Neu N）表达情况。结果显示,小鼠TG原代细胞能转录FOX3基因,同时小鼠TG原代细胞的Neu N表达为阳性,阳性率达90%以上。结果证明了本试验分离出来的细胞主要为神经元细胞。将1 MOI PRV感染TG细胞后,采用q PCR和Western blot分别检测不同时间段NF-κB信号通路相关蛋白转录和表达变化。结果显示,1 MOI PRV感染TG细胞后,My D88、TRIF和NF-κB p65 m RNA转录水平在早期显著下调（P＜0.05）,后期显著上调（P＜0.05）;PRV感染TG细胞后My D88、TRIF、IκBα和NF-κB p65蛋白表达总体来说早期处于下调状态,晚期处于上调状态,这一结果与m RNA转录变化情况相符,且PRV感染TG细胞后会持续诱导IκBα和NF-κB p65发生磷酸化,结果说明,PRV感染TG细胞后激活NF-κB信号通路。将1 MOI PRV感染TG细胞后,采用q PCR和ELISA方法分别检测不同时间段炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α转录和表达变化。结果显示,1MOI PRV感染TG细胞后,IL-1β和IL-6 m RNA转录水平在早期无明显差异,后期极显著上调（P＜0.001）,TNF-αm RNA转录水平无明显差异;1 MOI PRV感染TG细胞后,上清液中IL-6表达水平在早期无明显差异,后期极显著上调（P＜0.01）,未检测到IL-1β和TNF-α表达,细胞裂解液中IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平无明显差异,该结果中IL-6和TNF-α表达水平与m RNA转录水平相符,IL-1β表达水平与m RNA转录水平不符相符。2.PRV激活TG原代细胞NF-κB信号通路对炎症因子分泌的影响为了证实NF-κB抑制剂BAY 11-7082阻断TG细胞内NF-κB信号通路的效果,本实验使用CCK8试剂盒检测不同浓度NF-κB抑制剂BAY 11-7082对细胞活力的影响。结果显示,与BAY 11-7082浓度为0μM时相比,BAY 11-7082浓度为5μM、10μM和20μM时细胞活力极显著降低（P＜0.001）,BAY 11-7082浓度为1μM和2μM时细胞活力没有显著变化,因此本研究选取2μM BAY11-7082进行相关研究。采用Western blot对NF-κB信号通路阻断效果进行检测验证,结果显示2μM BAY 11-7082可有效抑制由PRV感染引起的TG细胞IκBα、NF-κB p65的磷酸化,说明BAY 11-7082可有效阻断TG细胞内NF-κB信号通路。为了探究NF-κB信号通路对PRV感染TG细胞后调控炎症因子分泌的影响,本试验将TG原代细胞培养于六孔板后,随机分为BAY 11-7082组、PRV组、BAY11-7082+PRV组和对照组4组,于PRV感染后12 h取样,采用q PCR检测细胞中IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA转录水平。结果显示:BAY11-7082+PRV组和PRV组相比IL-1β和IL-6 m RNA转录水平极显著下调（P＜0.01）,其他均无差异。使用ELISA检测各组中上清液和细胞裂解液中炎症因子表达水平,上清液中BAY11-7082+PRV组与PRV组相比IL-6表达水平极显著下调（P＜0.001）,4个组中都未检测到IL-1β和TNF-α表达;细胞裂解液中BAY 11-7082组、PRV组和BAY11-7082+PRV组与对照组相比,IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平都无明显差异。结果表明,PRV通过调节TG细胞NF-κB信号通路上调IL-1β和IL-6m RNA转录水平;PRV通过调节TG细胞NF-κB信号通路上调IL-6表达水平。3.PRV感染小鼠对三叉神经节NF-κB信号通路和炎症因子分泌的影响将10~5 TCID50 PRV滴鼻感染小鼠,小鼠在感染60 h后皆出现明显的临床症状,表现为躁动、瘙痒、抓挠面部皮肤以及面部其它部位并伴有皮肤损伤和出血,在感染72 h后开始出现死亡,80 h时全部死亡。在将10~5 TCID50 PRV感染小鼠后,同时采用q PCR和Western blot分别检测不同时间段NF-κB信号通路相关蛋白转录和表达变化。结果显示,PRV感染小鼠后,My D88、TRIF和NF-κB p65 m RNA转录水平在早期极显著下调（P＜0.01）,后期显著上调（P＜0.05）;PRV感染小鼠后My D88和TRIF的蛋白表达水平早期下调,后期上调,IκBα和NF-κB p65表达水平早期下调,之后上调,后期下调,这一结果与m RNA转录变化情况基本相符。并且PRV感染小鼠三叉神经节后会持续诱导IκBα和NF-κB p65发生磷酸化,结果说明PRV感染小鼠可激活三叉神经节NF-κB信号通路。PRV感染小鼠三叉神经节后NF-κB信号通路的变化规律和PRV感染TG细胞后NF-κB信号通路变化规律相符。将10~5 TCID50 PRV感染小鼠后,采用q PCR和ELISA方法分别检测不同时间段炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α转录和表达变化。结果显示,PRV感染小鼠后,三叉神经节中IL-1β和IL-6 m RNA转录水平在早期无差异,后期极显著上调（P＜0.001）,TNF-αm RNA转录水平无差异;PRV感染小鼠后,三叉神经节中IL-6表达水平在早期无明显差异,后期极显著上调（P＜0.001）,IL-1β和TNF-α表达水平无明显差异,该结果显示IL-6和TNF-α的表达水平与m RNA转录水平相符,IL-1β的表达水平与m RNA转录水平不符相符。PRV感染小鼠后三叉神经节炎症因子分泌规律与PRV感染TG细胞后炎症因子分泌规律基本相符。证明了PRV感染三叉神经节细胞后激活NF-κB信号通路并调控炎症因子分泌。