贵州黄鸡肌内脂肪沉积相关基因筛选及功能研究

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肌内脂肪含量(intramuscular fat,IMF)是影响肉质的重要因素,与肉的嫩度、风味以及水分密切相关。不同的品种肌内脂肪含量不同,即使在同一品种内,不同个体间的肌内脂肪含量也存在差异。但活体肌内脂肪含量通过屠宰后才能测得,且难于度量,所以寻找影响肌内脂肪沉积的相关基因一直是科学家研究的热点。贵州黄鸡是我国黄羽肉鸡的典型代表之一,具有性成熟早、易育肥的特点。因此,本文以贵州黄鸡不同肌内脂肪含量的个体为研究对象,以期从转录组水平分析影响贵州黄鸡肌内脂肪沉积的分子调控机理和信号通路,筛选影响贵州黄鸡肌内脂肪沉积的候选基因,并在细胞水平上进行验证,为黄羽肉鸡的肌内脂肪含量的选育提供理论依据。(1)选择在相同营养条件下饲养120日龄的贵州黄鸡30只,测定其屠宰性能和肉品质,脂肪酸组成和肌纤维特性等多个指标;根据IMF含量的高、低分为高肌内脂肪组(IMFH组)和低肌内含量组(IMFL组)。结果显示,IMFH组极显著高于IMFL组(P<0.01);两组间的屠宰性能差异不显著(P>0.05),IMFH组的胸肌剪切力与IMFL组差异极显著(P<0.01);两组中饱和脂肪酸均以棕榈酸含量最高;IMFH组中亚油酸极显著高于IMFL组(P<0.01),花生三烯酸显著高于IMFL组(P<0.05);IMFH组肌纤维密度极显著高于IMFL组(P<0.01)。相对于IMFL组,IMFH组的肉质较IMFL组好。(2)从IMFH组与IMFL组各选取4个最高(H组,n=4)和最低(L组,n=4)的胸肌组织样进行转录组测序。两组间共筛选到259个差异表达基因,195个基因表达上调,64个基因表达下调,粘着斑、ECM-受体相互作用、细胞黏附分子、肌动蛋白细胞骨架调节、PPAR信号通路等5条通路可能参与了IMF沉积过程;其中,差异表达基因在粘着斑通路和ECM-受体相互作用通路极显著富集,这两条通路上的部分基因(CAPN2,COL1A1,COL1A2,COL6A1,COL6A2,COL6A3)可能是影响肌内脂肪沉积的关键基因;随机选取上调基因(CAPN2、PLTP、ABHD6)和下调基因(LPIN1、ANKRD2、MCEE)6个差异表达基因进行荧光定量PCR验证,qPCR的表达水平与RNA-Seq测序结果一致。(3)利用荧光定量PCR检测干扰COL1A1基因在鸡前脂肪细胞中对脂肪沉积相关基因LAMA3、ABHD6、LPIN1、PTGS2、PLTP的m RNA表达水平,通过构建COL1A1基因的RNA干扰慢病毒载体,培养鸡前脂肪细胞、成脂诱导分化、油红O染色等技术检测干扰COL1A1基因对肌内脂肪沉积的影响。结果显示,干扰COL1A1基因后,48h、72h和96h三个时间点脂肪细胞增殖能力降低;通过油红O染色观察成脂诱导分化后的4d和8d两个时间点,脂肪细胞分化和脂滴沉积能力显著下降。qPCR结果显示,4d时,脂肪沉积相关基因LAMA3、ABHD6、PTGS2的相对表达量显著下降(P<0.05),8d时,ABHD6、LPIN1、PTGS2极显著下降(P<0.01);4d和8d转染干扰COL1A1后,甘油三脂和胆固醇含量均显著下降(P<0.01)。综上,本文通过比较贵州黄鸡不同肌内脂肪含量,肌内脂肪含量增加,饱和脂肪酸含量则随之提高,还具有更致密的肌纤维,肉质营养丰富;通过转录组测序筛选到259个差异表达基因,这些差异表达基因极显著富集在粘着斑和ECM-受体相互作用通路上,其中,这两条通路的基因(CAPN2,COL1A1,COL1A2,COL6A1,COL6A2,COL6A3)可能在肌内脂肪沉积过程中发挥重要的调控作用;在鸡前脂肪细胞中,COL1A1基因促进脂肪细胞增殖分化和脂质沉积能力;COL1A1基因能够促进鸡前脂肪细胞甘油三酯和胆固醇含量的积累,对脂肪沉积相关基因LAMA3、ABHD6、LPIN1、PTGS2存在调控作用。
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