【摘 要】
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近年来以CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）系统为代表的新型基因编辑技术能高效地在在基因组靶位点引入DNA双链断裂（double strand break,DSB）,从而能有效介导下游的基因敲除（Knock out,KO）和基因敲入（Knock in,KI）效率。目前KI已在基因功
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近年来以CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）系统为代表的新型基因编辑技术能高效地在在基因组靶位点引入DNA双链断裂（double strand break,DSB）,从而能有效介导下游的基因敲除（Knock out,KO）和基因敲入（Knock in,KI）效率。目前KI已在基因功能研究、基因修饰动物制作、动物育种等领域获得广泛应用。但由同源定向修复（homologous-directed repair,HDR）介导的KI效率依然低下。KI操作对于精确的基因组修饰具有十分重要的作用,可以通过特定的基因型修饰而赋予物种特定的表型,因此如何提升KI效率仍然值得深入研究。本研究尝试筛选提升HDR效率的小分子化合物,为在细胞上进行高效的KI操作提供一种便捷的方案。我们以293T细胞为研究对象,利用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复（homologous-directed repair,HDR）方式从182种小分子化合物筛选得到多种能提高CRISPR/Cas9的小分子化合物。我们首先成功构建基于293T细胞ACTB与GAPDH基因位点的CRISPR/Cas9系统和EGFP荧光报告载体,这样可以通过荧光修复的效率直观便捷地筛选促进HDR效率的小分子化合物。我们在ACTB基因位点和GAPDH基因位点分别筛选出88种和63种提高HDR效率的小分子化合物,其中29种小分子化合物对两个基因位点有共同提高作用,特别是化合物Peficitinib与4SC-202促进HDR效率具有最显著的效果。我们发现5μM的Peficitinib可以使HDR效率相比对照组提高2.2倍;1μM的4SC-202可以使HDR效率提高2.5倍;Peficitinib和4SC-202联合使用效果不显著。且经CCK8试剂盒检测两种小分子化合物对细胞毒性保持在正常水平。我们进而对化合物Peficitinib与4SC-202提高CRISPR/Cas9介导的HDR效率的作用机制进行初步探究。经Peficitinib和4SC-202处理后,分布于G0/G1期和S期的细胞数量减少,而分布于G2/M期的细胞数量显著增加1倍以上,表明两种化合物调控细胞周期（Cell cycle）延长停留在G2/M期的时间;Peficitinib和4SC-202处理293T细胞后,HDR相关因子和NHEJ相关因子表达都出现上调。由于4SC-202是一种组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase,HDAC）抑制剂,我们猜测可能抑制HDAC可以提升细胞染色质的乙酰化水平,从而保持染色质的开放状态,为基因编辑效率的提高创造有利条件。因此我们以小干扰RNA（Small interfere RNA,si RNA）抑制293T细胞的HDAC水平。结果发现HDAC1和HDAC2基因表达下调可以促进CRISPR/Cas9介导的HDR效率,HDAC3基因表达下调对基因组HDR效率具有抑制作用。因此我们认为HDAC抑制剂4SC-202提高HDR效率可能与改变染色质状态和调控细胞周期有关;JAK抑制剂Peficitini提高HDR效率可能与阻断JAK/STAT信号通路和调控细胞周期有关。
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