论文部分内容阅读
[目的]精神分裂症病因复杂,发病机制不明。患者因受病情支配易发生自杀、自残等伤害自己的行为以及攻击他人、破坏物品等严重威胁社会公共安全的肇事肇祸行为,给患者家属和社会带来巨大的精神压力和经济负担,是当前备受关注和亟待解决的重大医疗和社会问题。目前的诊断主要依据病史及精神检查,缺乏可靠、高效、重复性好的客观生物学指标,诊断易受主观影响,给精神分裂症的司法鉴定增加了难度。遗传-环境因素是精神分裂症发病的主导因素。有研究发现,个体生命早期的不良经历会导致应激相关的下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA）的异常激活。而HPA异常所致的功能失调已被证实与精神分裂症、抑郁症等多种精神疾病密切相关,但是具体的机制尚未阐明。因此,本研究以HPA轴两个关键受体基因NR3C1和NR3C2为靶基因,从遗传学和表观遗传学角度对NR3C1和NR3C2基因单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）及启动子DNA甲基化与精神分裂症的关联性及表达调控机制以及基因的生物学功能进行研究,为阐明精神分裂症的发病机制提供理论依据,为精神分裂症的预测、诊疗及药物设计提供新的思路,为精神分裂症的司法鉴定寻找潜在的生物学指标。[方法]1.收集精神分裂症患者和健康对照的外周血提取基因组DNA。根据国内外文献报道以及NCBI db SNP和HapMap数据库资料,按照MAF＞0.1的标准,选择 NR3C1基因的五个 SNP 位点（rs6191、rs6198、rs6190、rs56149945、rs41423247）和NR3C2 基因的四个 SNP 位点（rs2871、rs5522、rs5525 和rs2070951）进行研究。采用改良的多重高温连接酶检测反应技术iMLDR进行基因分型检测,应用SPSS 22.0、SHEsis、MDR 3.0.2软件进行统计分析。2.通过miRBase和SNP info数据库预测可能与NR3C1基因3’-UTR区rs6191结合的microRNA（miRNA）,利用双荧光素酶报告基因检测系统验证rs6191位点与候选miRNA的结合能力。体外的培养细胞中加入miR-422amimics,使用实时荧光定量 PCR（Real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测 miR-422a对细胞内源性NR3C1基因mRNA表达的影响。收集精神分裂症患者和健康对照的外周血提取RNA,用RT-qPCR检测NR3C1基因的mRNA表达和miR-422a 的表达,用酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测NR3C1的蛋白表达。3.采集精神分裂症患者和健康对照组的外周血,用QIAamp DNABlood Mini Kit提取基因组DNA,用EZ DNA Methylation-Gold Kit对DNA进行重亚硫酸盐处理,采用MethylTarget技术通过Illumina Hiseq平台进行高通量测序,对NR3C1和NR3C2基因启动子区DNA甲基化水平进行检测,对DNA甲基化与精神分裂症的关联性进行分析,并分析基因-环境的交互作用。4.以甲基化载体为基本骨架,构建含NR3C1和NR3C2基因启动子片段的重组质粒,将质粒进行体外甲基化,采用双荧光素酶报告基因检测系统研究甲基化对启动子转录活性的影响。用JASPAR数据库预测候选功能位点结合的转录因子,用凝胶迁移率实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）验证候选CpG位点对转录因子结合的影响。用甲基化抑制剂5’-杂氮胞苷研究去甲基化对细胞内源性NR3C1和NR3C2基因mRNA表达的影响。用RT-qPCR和ELISA分别检测外周血中NR3C2基因的mRNA和蛋白表达。5.用视黄酸RA诱导SH-SY5Y细胞分化,用Image J软件测量细胞神经突的长度,用RT-qPCR检测神经细胞特异性标志基因MAPT、MAP2、SYP以及NR3C1和NR3C2的mRNA表达。应用siRNA敲低细胞中NR3C1和NR3C2基因的表达,用RT-qPCR和WB验证敲低效率,敲低后用RA诱导,Image J软件测量神经突的长度,RT-qPCR检测神经细胞标记基因的mRNA表达。CCK-8实验检测NR3C1和NR3C2基因敲低对SH-SY5Y细胞增殖的影响。6.通过转录组测序分析SH-SY5Y细胞中敲低NR3C1和NR3C2基因后的差异表达基因,在排名前30的差异表达基因中随机选择十个基因用RT-qPCR对转录组测序的结果进行验证。通过GO和KEGG分析初步探讨NR3C1和NR3C2基因在精神分裂症中可能发挥的生物学功能。[结果]1.NR3C1基因3’-UTR rs6191位点与女性精神分裂症显著相关,rs6191位点携带CC基因型的女性群体发生精神分裂症的风险比AA或AC基因型高。NR3C2基因rs2871、rs5522、rs5525和rs2070951的等位基因和基因型频率分布在两组间均无统计学差异。rs5522与rs5525之间为强连锁不平衡（D’=1.000,r2=0.974）,单倍型分布无显著差异。NR3C1基因和NR3C2基因的SNP位点存在交互作用,rs6191/rs5522/rs2871为最佳模型,交叉验证一致性均为10/10。2.生物信息学分析预测到 7 个 miRNAs（miR-574-5P、miR-422a、miR-1183、miR-8485、miR-362-3p、miR-377 和 miR-570）可能与 rs6191 位点结合。双荧光素酶报告基因检测发现hsa-miR-422a抑制萤火虫荧光素酶的表达,在野生型中的抑制程度显著高于突变型。在细胞中过表达miR-422a时发现NR3C1基因的表达明显受抑制,加入miR-422a抑制剂时发现NR3C1表达量上调,表明miR-422a能够调控NR3C1基因的表达。精神分裂症患者NR3C1基因的mRNA和蛋白表达显著低于健康对照组,miR-422a的表达显著高于健康对照组。通过SZDB数据库发现在海马、前额叶皮质和纹状体中,精神分裂症患者的NR3C1基因表达水平降低。3.精神分裂症患者女性群体中NR3C1-1B和NR3C2-4的甲基化水平显著高于健康对照组,发现多个CpG位点的甲基化程度在两组间具有显著性差异且存在性别特异性。低文化程度、未婚群体罹患精神分裂症的风险高于高文化程度和已婚群体。精神分裂症患者的文化程度、婚姻和吸烟状况与基因的甲基化水平相关。4.NR3C1-1H、NR3C2-2、NR3C2-4的甲基化会抑制基因的转录活性。JASPAR数据库预测到多个可能与候选CpG位点结合的转录因子,EMSA结果表明候选CpG位点能够影响转录因子的结合。去甲基化处理后细胞中NR3C1和NR3C2基因的mRNA表达上调。精神分裂症患者NR3C2基因的mRNA和蛋白表达都显著低于健康对照组。通过SZDB数据库发现精神分裂症患者大脑额叶皮质中的NR3C2基因表达低于健康对照组。5.通过PsychENCODE数据库发现NR3C1和NR3C2基因在胎儿大脑发育过程中上调,RA能够诱导SH-SY5Y细胞分化,神经突明显延长,同时神经细胞标志基因MAPT、MAP2和SYP基因的mRNA表达量都显著上调,表明SH-SY5Y神经分化细胞模型建立成功。NR3C1和NR3C2基因敲低后SH-SY5Y细胞神经突明显延长。CCK-8实验结果表明敲低NR3C1和NR3C2基因能够促进SH-SY5Y细胞增殖。6.转录组测序结果表明NR3C1和NR3C2基因敲低后分别引起388和296个差异基因表达,其中有72个差异表达的基因有交集。经RT-qPCR验证转录组测序结果可靠。GO和KEGG分析发现差异表达基因主要参与细胞连接、生物调节、对应激的反应、发育等过程,富集在趋化因子介导的信号通路、MAPK、发育过程与环境信息处理相关的信号转导、细胞增殖,生长和死亡及神经退行性疾病等过程。[结论]1.NR3C1基因3’-UTR区rs6191与女性群体的精神分裂症相关,可能通过结合miR-422a调控NR3C1基因的表达介导精神分裂症的发生和发展。2.NR3C1和NR3C2基因启动子DNA甲基化与精神分裂症相关,并具有性别特异性,高甲基化状态更容易罹患精神分裂症。文化程度和婚姻状况是精神分裂症的风险因素,并且与精神分裂症发生交互作用影响基因的甲基化水平。3.NR3C1-1H、NR3C2-2、NR3C2-4甲基化抑制基因的转录活性,CpG位点能够影响转录因子的结合能力,去甲基化处理能够促进NR3C1和NR3C2基因的mRNA表达。4.精神分裂症患者外周血中NR3C1和NR3C2基因的mRNA和蛋白表达显著低于健康对照组,且与SZDB数据库中脑组织中的表达趋势一致。5.NR3C1和NR3C2基因在调节神经分化、神经突生长以及神经细胞增殖中发挥重要作用。转录组测序结果表明NR3C1和NR3C2基因可能通过影响环境信息处理相关的信号转导、发育、细胞生长和死亡以及MAPK等信号通路介导精神分裂症的发生和发展。