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[目 的]免疫细胞过度活化在系统性红斑狼疮（SLE）的发病机理中起关键作用,miRNA作为负反馈调节因子对免疫应答的调控是研究热点,我课题组通过二代高通量测序发现SLE中miR-99a-3p表达下降,然而具体机制尚不清楚。本研究目的是探讨miR-99a-3p潜在靶基因,靶细胞及其影响SLE发生的潜在机制,有望为SLE的靶向治疗提供新的思路。[方 法]一、miR-99a-3p在SLE表达差异及其在细胞系中功能验证并明确靶基因。1.经昆明医科大学第二附属医院伦理委员会批准,对来自10例藏族SLE患者与10例藏族健康对照者的PBMC进行二代高通量测序及生信分析,RT-qPCR检测差异显著的miRNA,选取miR-99a-3p为研究对象。检测10例藏、汉族SLE患者与10例藏、汉族健康人PBMC中miR-99a-3p的表达水平。2.miR-99a-3p 激动剂（agomir）、拮抗剂（antagomir）、正常对照（NC）转染 Ball-1、Jurkat、THP-1和K562细胞,CCK-8法检测细胞增殖、PI法检测细胞周期、流式细胞术检测细胞凋亡,明确转染后增殖、周期、凋亡变化及变化相对稳定细胞系。3.对miR-99a-3p靶基因进行生物信息学预测,RT-qPCR检测预测靶基因在SLE患者/正常人PBMC及不同细胞系转染后的表达情况,双荧光素酶结果确定miR-99a-3p的调控靶点和调控关系。二、miR-99a-3p及靶基因通过自噬影响B细胞的功能。1.RT-qPCR、Western blotting检测SLE患者/正常人的真核翻译起始因子4E结合蛋白1（EIF4EBP1）、微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）、溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP-2A）mRNA及蛋白表达水平。2.分离正常人外周血B淋巴细胞,RT-qPCR、Western blotting检测转染Ball-1细胞、正常人原代B细胞后miR-99a-3p及自噬相关基因、蛋白变化,荧光显微镜观察转染后LC3B免疫荧光情况。3.SiRNA与antagomir共同干预Ball-1细胞进行Rescue实验,观察转染后增殖、周期、凋亡变化,EIF4EBP1、LC3B、LAMP-2A蛋白表达及LC3B免疫荧光情况。4.使用50mj/cm2的中波紫外线（UVB）照射Ball-1和正常人原代B细胞,RT-qPCR 检测照射后 miR-99a-3p、EIF4EBP1、LC3B 和 LAMP-2A 的表达。三、动物模型中miR-99a-3p及靶基因通过自噬影响SLE疾病发生。以C57BL/6J小鼠为对照,在MRL/lpr小鼠基础上构建miR-99a-3p过表达和干扰模型,检测小鼠尿蛋白定量,分离B淋巴细胞后RT-qPCR、Western blotting检测miR-99a-3p、靶基因EIF4EBP1和自噬通路LC3B、LAMP-2A mRNA及蛋白表达水平。ELISA检测血浆 ANA、dsDNA、IgE、IgM、IL-6、IL-10、B 淋巴细胞刺激因子（BLyS）。通过病理分析小鼠肾脏组织HE染色及C3免疫荧光沉积,免疫组化检测肾脏组织中靶基因及通路蛋白变化。[结 果]一、miR-99a-3p在SLE表达差异及其在细胞系中功能验证并明确靶基因。1.藏族、汉族SLE患者miR-99a-3p较健康对照均下降,且差异显著（P＜0.05）,Ball-1转染miR-99a-3p激动剂后细胞增殖减弱,凋亡增加,转染miR-99a-3p拮抗剂后变化相反（P＜0.05）,选取B细胞为研究对象。2.SLE患者PBMC中EIF4EBP1、NCAPG、IKBKB、PRKCB表达水平高于健康对照者（P＜0.05）。Ball-1、Jurkat、THP-1 和 K562 细胞转染miR-99a-3p 激动剂后EIF4EBP1、NCAPG、IKBKB、PRKCB 与 NC 组相比下降,转染 miR-99a-3p 拮抗剂后变化相反（P＜0.05）。3.萤光素酶报告基因检测证明miR-99a-3p直接靶向EIF4EBP1 mRNA。二、miR-99a-3p及靶基因通过自噬影响B细胞的功能。1.SLE患者EIF4EBP1、LC3B、LAMP-2A在mRNA及蛋白水平均高于健康对照者（P＜0.05）。2.Rescue 实验证实了 miR-99a-3p 和 EIF4EBP1 的相互作用模型。3.UVB照射Ball-1和正常人原代B细胞后miR-99a-3p表达下降,而EIF4EBP1、LC3B、LAMP-2A表达上调（P＜0.05）。4.体外细胞（Ball-1,正常人原代B细胞）水平进一步证实上调miR-99a-3p的表达可以降低靶基因EIF4EBP1和自噬通路LC3B、LAMP-2A在转录及翻译水平的表达,同时降低LC3B免疫荧光强度,下调miR-99a-3p的表达作用相反（P＜0.05）。三、动物模型中miR-99a-3p及靶基因通过自噬影响SLE疾病发生。体内实验（MRL/lpr狼疮鼠原代B细胞）水平进一步证实上调miR-99a-3p的表达可以降低EIF4EBP1、LC3B、LAMP-2A mRNA、蛋白水平及免疫组化水平的表达,同时降低C3免疫荧光强度,下调miR-99a-3p的表达作用相反（P＜0.05）。尾静脉注射miR-99a-3p激动剂MRL/lpr狼疮鼠血清ANA、dsDNA、IgE、IgM、IL-6、IL-10、BLyS及尿蛋白定量低于尾静脉注射阴性对照（NS）MRL/lpr狼疮鼠,尾静脉注射miR-99a-3p拮抗剂狼疮鼠相关指标均高于尾静脉注射NS狼疮鼠（P＜0.05）。[结 论]SLE PBMC中的miR-99a-3p表达下调,通过模拟转染上调miR-99a-3p可以保护B细胞mRNA和蛋白质水平上不受EIF4EBP1介导的自噬的侵害,下调miR-99a-3p则产生相反的作用。miR-99a-3p的下调通过调节SLE B细胞中EIF4EBP1介导的自噬信号通路而诱导自噬。这些结果表明,miR-99a-3p、EIF4EBP1可能成为SLE潜在的治疗靶标。