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研究背景及目的缺血再灌注（ischemia-reperfusion,I/R）是术后急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）的重要原因,在ICU患者中发生率高,造成的死亡率高,且缺少特异性的治疗方法。尽早干预是治疗缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury,IRI）及预防其诱导的AKI最有效的方式。单核巨噬细胞作为先天免疫的先锋之一,再灌注后迅速浸润入肾脏,并在24h内大量增加。再灌注后急剧增加的ROS激活巨噬细胞。持续的ROS氧化攻击导致巨噬细胞氧化损伤,引起促炎细胞因子的释放、细胞凋亡,进一步影响周围的先天免疫细胞和肾实质细胞。肾脏内激活状态下的巨噬细胞可促进自身和肾内氧化应激爆发和炎症级联放大。但巨噬细胞除了作为效应细胞加速肾损伤外,是否还发挥着其他的调控作用尚不明确。以活性氧（reactive oxygen species,ROS）为代表的自由基损伤在AKI早期病理生理过程中起着关键作用。缺血再灌注早期,爆发的自由基攻击肾实质细胞,尤其是对缺血缺氧最敏感的肾小管上皮细胞。坏死和损伤的肾小管上皮细胞释放损伤相关模式分子、趋化因子等招募循环免疫细胞迅速进入肾脏,从而激活先天免疫反应。以活性氧（reactive oxygen species,ROS）为代表的自由基可致肾小管上皮细胞严重氧化损伤,诱发炎症瀑布和细胞凋亡,进而损害肾脏功能。I/R直接诱导上调肾小管上皮细胞表面的Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）。经损伤相关模式分子激活的TLR4或ROS均可激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路导致促炎细胞因子产生,进一步放大炎症,引发凋亡。故减轻其氧化损伤和抑制MAPK信号通路对保护肾脏非常有益。氧化应激的负调控涉及抗氧化系统。核因子NF-E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）是抗氧化系统中的关键转录因子,能上调另一抗氧化因子血红素加氧酶-1（hemo oxygenase 1,HO-1）,二者共同清除细胞内的自由基。不论是肾实质细胞内还是巨噬细胞内,Nrf2和HO-1的上调均可减轻细胞内氧化应激,恢复细胞稳态,保护肾脏功能。C型凝集素18A（C-type lectin domain family 18 member A,CLEC18A）是近年发现的一种新型的可溶型C型凝集素,以分泌蛋白的形式发挥作用。其广泛表达于人类外周血细胞,并在单核细胞分化为巨噬细胞时表达进一步上调。作为C型凝集素受体家族中唯一具有外分泌特性的分子,CLEC18A相关的研究仅有六篇,始于2015年首次被发现及其分子结构的解析。其余文章涉及病毒和免疫增强领域。但它在肾缺血再灌注损伤（renal ischemia-reperfusion injury,RIRI）中的作用及机制未见报道。我们构建了髓系细胞特异性敲除CLEC18A小鼠,以此为基础,建立RIRI小鼠模型,旨在探究髓系细胞来源的CLEC18A在RIRI过程中的作用,并探讨其可能的作用机制。研究方法（一）动物实验1.肾缺血再灌注损伤小鼠模型构建实验选择同批次且体重相近的C57BL/6小鼠（雄性8周,体重25±1g）,按简单随机分组。手术采用双侧肾蒂钳夹45min后分别再灌注0h、1h、3h、6h、12h、24h,取血清与肾组织样本。（1）血清:全自动生化仪检测BUN、SCr。酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测CLEC18A蛋白。（2）肾组织:ELISA检测CLEC18A蛋白。2.基于髓系细胞特异性敲除CLEC18A小鼠的动物实验髓系细胞特异性敲除CLEC18A小鼠的构建:委托南方模式动物中心完成。选择同窝且体重相近的小鼠（8-10周,体重22±2g）进行分组和后续实验:（1）CLEC18Afl/flLys MCre-组（剖腹假手术）;（2）CLEC18Afl/flLys MCre+组（剖腹假手术）;（3）I/R-CLEC18Afl/flLys MCre-组（双侧肾蒂夹闭45min再灌注24h）;（4）I/R-CLEC18Afl/flLys MCre+组（双侧肾蒂夹闭45min再灌注24h）。采用上述小鼠RIRI模型,假手术或再灌注24h后取血清与肾脏组织样本。（1）血清:全自动生化仪检测BUN、SCr。（2）肾组织:ELISA检测丙二醛（malonaldehyde,MDA）含量、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白介素-6（interleukin-6,IL-6）表达。苏木精和伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色检测肾组织结构损伤。ROS染色检测肾内氧化应激。末端脱氧核苷酸转移酶d UTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase d UTP nick end labeling,TUNEL）染色检测肾内凋亡。蛋白质印记（Western blot,WB）检测肾内抗氧化相关蛋白、炎症相关蛋白、凋亡相关蛋白表达情况。（二）体外实验小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7即巨噬细胞系培养于10%杜氏改良Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium,DMEM）即DMEM+10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）。采用高表达CLEC18A质粒和H2O2处理细胞。（1）H2O2诱导RAW264.7巨噬细胞系氧化损伤实验:分组设置5个H2O2浓度梯度（0,100,200,400,800μM）,并刺激24h。（2）H2O2诱导RAW264.7巨噬细胞系氧化损伤的适宜处理时间实验:分组设置5个时间点（0,3,6,12,24h）,H2O2刺激浓度为200μM。（3）高表达（overexpress,OE）CLEC18A对于RAW264.7巨噬细胞系的安全性实验:分组设置2组（vector、OE）,高表达CLEC18A 24h。（4）高表达CLEC18A对RAW264.7巨噬细胞系氧化损伤保护的机制探究实验:分组设置4组（vector、OE、H2O2、H2O2+OE）,高表达CLEC18A 24h,后加入H2O2（200μM）共孵育24h。实验1-4均采用细胞计数试剂（cell counting kit-8,CCK8）检测细胞损伤情况。实验1-2进一步进行:流式细胞术检测细胞内ROS产生。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）检测CLEC18A。实验3进一步进行:qPCR检测CLEC18A。实验4进一步进行:ELISA检测MDA含量。WB检测细胞内抗氧化相关蛋白。qPCR检测TNF-α、IL-6。结果1.CLEC18A在小鼠RIRI后表达上调。2.髓系细胞特异性敲除CLEC18A小鼠RIRI较同窝对照小鼠更严重。3.髓系细胞特异性敲除CLEC18A小鼠肾缺血再灌注后肾内氧化应激、炎症和凋亡较同窝对照小鼠更严重。4.在RAW264.7巨噬细胞系中,高表达CLEC18A可减轻H2O2诱导的氧化应激、炎症。这种保护作用可能与上调Nrf2/HO-1信号通路和下调促炎细胞因子有关。结论我们首次发现,肾脏I/R可诱导CLEC18A表达上调,髓系细胞特异性敲除CLEC18A小鼠RIRI加重。机制探讨结果提示,CLEC18A可减轻RIRI小鼠的肾内氧化应激、炎症和凋亡。在巨噬细胞中,H2O2可诱导CLEC18A表达上调,内源性高表达CLEC18A可减轻H2O2诱导的氧化损伤,该作用可能与上调Nrf2/HO-1信号通路和下调促炎细胞因子有关。这一结果为临床治疗RIRI提供了潜在的新途径。在理论层面,本研究提示,I/R诱导髓系来源的CLEC18A蛋白上调并分泌到胞外以自分泌或旁分泌的形式作用于自身或周围细胞,调控这些细胞的功能,从而起到抑制氧化应激,减轻小鼠RIRI的作用。这种调节机制是机体本身所固有的调节方式。我们的研究扩展了髓系细胞在RIRI中的调控研究。不足之处:1.除髓系细胞外,未能明确RIRI中CLEC18A的其他细胞来源。2.未能深入探讨CLEC18A对肾脏其他细胞的调控作用。3.未能深入阐明CLEC18A对巨噬细胞氧化应激反应的调控机制。