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目的:从分子、细胞以及动物水平等层次阐明蛋白质精氨酸甲基化修饰对天然免疫TLR4信号通路的调节机制,揭示精氨酸甲基化修饰对TLR4信号通路的影响以及TLR4精氨酸甲基化在内毒素血症发生发展的关系,为内毒素血症的防治提供一个新的靶点。方法:(1)PRMT2介导TLR4发生精氨酸甲基化修饰。用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)处理Raw264.7细胞,利用IP结合WB技术检测TLR4精氨酸甲基化水平。将蛋白质精氨酸甲基化转移酶HA-PRMT1、HA-PRMT2、HA-PRMT3分别与Myc-TLR4-CD共转染或者单独转染Myc-TLR4-CD到293T细胞中,利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)结合WB技术检测TLR4-CD精氨酸甲基化水平变化及其相互作用,筛选出精氨酸甲基化修饰功能最强的PRMT。在Raw264.7中用RNA干扰技术下调初步筛选出的PRMT2表达,LPS处理后利用IP结合WB技术检测TLR4精氨酸甲基化修饰水平。将原核表达质粒His-TLR4-CD转化到大肠杆菌中获得大量原核表达蛋白,经过纯化和透析后结合IP、WB技术从体外验证TLR4-CD精氨酸甲基化修饰水平。(2)检测PRMT2活性位点对TLR4精氨酸甲基化修饰水平的影响。构建Myc-TLR4-CD突变体,在293T细胞中共转染HA-PRMT2和以上野生型和突变型Myc-TLR4-CD,用IP结合WB技术检测Myc-TLR4-CD精氨酸甲基化水平。构建HA-PRMT2突变体(HA-PRMT2-H112Q、M115I),在293T细胞中共转染Myc-TLR4-CD和以上野生型和突变型HA-PRMT2,用IP结合WB技术检测Myc-TLR4-CD精氨酸甲基化水平。(3)检测不同位点的精氨酸甲基化修饰对IRF3和TLR4之间的相互作用的影响。用LPS处理Raw264.7细胞,利用Co-IP结合WB技术检测TLR4与IRF3相互作用水平。在293T细胞中将Flag-IRF3和以上野生型和突变型Myc-TLR4-CD共转染,用Co-IP结合WB技术检测TLR4-CD与IRF3之间的互相作用。用LPS处理Raw264.7细胞,利用IP结合WB技术检测IRF3的精氨酸甲基化修饰水平。将Flag-IRF3单独转染或与HA-PRMT1、HA-PRMT2、HA-PRMT3共转染到293T细胞中,利用IP、Co-IP结合WB技术检测Flag-IRF3精氨酸甲基化水平变化及其以上分子之间相互作用,筛选出精氨酸甲基化修饰功能最强的PRMT。在Raw264.7细胞中用RNA干扰技术下调初步筛选出的PRMT2,利用IP结合WB技术检测IRF3精氨酸甲基化修饰水平。将原核表达质粒GST-IRF3诱导表达、纯化、透析后结合GST-pull down、WB技术从体外验证IRF3精氨酸甲基化修饰水平。构建IRF3突变体,在293T细胞中共转染Myc-TLR4-CD和以上野生型和突变型Flag-IRF3,用Co-IP结合WB技术检测Myc-TLR4-CD与IRF3之间的相互作用。在293T细胞中共转染HA-PRMT2和以上野生型和突变型Flag-IRF3,用IP结合WB技术检测Flag-IRF3的精氨酸甲基化修饰水平。(4)检测LPS介导的精氨酸甲基化修饰对IRF3活性的影响。将Myc-IRF3和以上野生型和突变型Flag-IRF3共转染,用Co-IP结合WB技术检测IRF3二聚化。在Raw264.7细胞中分别转染野生型和突变型Flag-IRF3,LPS处理或不处理之后用免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)检测转录因子IRF3在细胞内核转移的情况。将Flag-TLR4单独或与HA-PRMT1、HA-PRMT2、HA-PRMT3共转染到293T细胞中,LPS处理后利用荧光素酶报告基因技术检测IRF3反应元件活性。将Flag-TLR4单独或与以上野生型和突变型HA-PRMT2共转染到293T细胞中,LPS处理后利用荧光素酶报告基因技术检测IRF3反应元件活性。将野生型和突变型Flag-TLR4转染到293T细胞中,LPS处理以上细胞后利用荧光素酶报告基因技术检测IRF3反应元件活性。(5)检测TLR4精氨酸甲基化修饰对炎性因子IFN-β产生影响。将野生型和突变型Flag-TLR4转染分别转染到293T和TLR4基因敲除的骨髓来源的巨噬细胞(TLR4-/-BMDM)中,利用RT-q PCR技术检测IFN-β表达。在Raw264.7细胞中用RNA干扰技术下调PRMT2表达,LPS处理以上细胞后利用酶联免疫吸附测定技术(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测炎症因子IFN-β的水平。(6)应用动物实验探讨蛋白质精氨酸甲基化修饰在内毒素血症中的作用。用LPS和等量生理盐水分别处理实验组和对照组BALB/c小鼠,处死小鼠后,应用免疫组化和HE染色技术检测小鼠肺组织中TLR4、IFN-β表达及其TLR4精氨酸甲基化水平,并进行统计学分析。结果:(1)LPS以时间依赖性的方式诱导TLR4发生精氨酸甲基化修饰;(2)PRMT1、PRMT2、PRMT3可分别催化TLR4-CD发生精氨酸甲基化修饰,其中PRMT2对TLR4-CD精氨酸甲基化作用最显著;(3)TLR4-CD可以分别与PRMT1、PRMT2和PRMT3相互作用;(4)下调PRMT2表达显著抑制LPS诱导的TLR4的精氨酸甲基化水平;(5)原核表达实验证实TLR4-CD发生精氨酸甲基化修饰;PRMT2第115位甲硫氨酸介导TLR4-CD在多位点发生精氨酸甲基化修饰;(6)TLR4-CD第731和812位精氨酸发生甲基化修饰;(7)LPS诱导TLR4和IRF3发生相互作用;(8)TLR4-CD第812位精氨酸介导其与IRF3相互作用;(9)LPS诱导IRF3的精氨酸甲基化水平呈时间依赖性增强;PRMT1、PRMT2、PRMT3可分别催化IRF3发生精氨酸甲基化修饰,其中PRMT2对IRF3精氨酸甲基化作用最显著;(10)下调PRMT2表达显著抑制LPS诱导的IRF3的精氨酸甲基化水平;(11)原核表达实验证实IRF3发生精氨酸甲基化修饰;(12)IRF3第285精氨酸部分介导了IRF3的精氨酸甲基化修饰及TLR4-CD与IRF3之间的相互作用;(13)IRF3第285精氨酸部分介导IRF3的二聚化以及LPS诱导的IRF3从细胞质向细胞核的转移;(14)PRMT1和PRMT2增强LPS诱导的IRF3反应元件活性;(15)PRMT2第115位甲硫氨酸和第112位组氨酸分别介导LPS诱导的IRF3反应元件活性;(16)TLR4第731和812位精氨酸分别介导LPS诱导的IRF3反应元件活性,且第812位精氨酸作用最强;(17)TLR4第812位精氨酸增强IFN-β的基因表达水平;(18)下调PRMT2表达后,IFN-β的蛋白表达水平显著降低;(19)内毒素血症动物实验证实,LPS诱导TLR4、IFN-β表达及精氨酸甲基化水平显著增强。结论:(1)LPS通过蛋白质精氨酸甲基化转移酶PRMT2催化TLR4在第731和812位精氨酸发生甲基化修饰;(2)蛋白质精氨酸甲基化修饰通过增强TLR4/IRF3信号通路增加IFN-β的产生,促进内毒素血症的发展。