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研究背景:男性不育的发病人数每年都在增加,严重困扰着男性的身心健康,并已成为一个全球性问题。精子参数异常,例如特发性少精子症、弱精子症和畸形精子症等,会导致男性因素不育。研究表明,线粒体在人类精子运动中起着重要作用,但相关的发病机制远未阐明。GRIM-19（Geneassociatedwithretinoid-interferon-inducedmortality 19）是线粒体呼吸链复合体I的功能亚基,在细胞能量代谢和线粒体膜电位的维持中发挥作用。线粒体作为能量提供者是精子活力的基础。GRIM-19在精子活性调控中的作用及其机制需要进一步研究。研究目的:探讨GRIM-19表达与弱精子症之间的相关性,并研究其机制。研究方法:1.精子实验:使用CRISPR/CaS9基因组工程构建GRIM-19基因敲除小鼠模型,评估GRIM-19表达对精子质量的影响。收集附睾精子用于精子计数和活力分析,Diff-Quik方法检测小鼠精子形态,HE染色法检测睾丸及附睾组织学差异,流式细胞术检测精子线粒体膜电位、活性氧及凋亡水平。2.动物实验:ELISA检测GRIM-19敲除小鼠血清中的睾酮水平,免疫组化分析检测GRIM-19、CYP11A1和3β-HSD在GRIM-19敲除小鼠睾丸中的表达和定位,定量RT-PCR和Western blot研究睾酮生物合成所需StAR、CYP11A1和3β-HSD的表达。3.原代细胞实验:体外分离培养鉴定小鼠睾丸间质细胞,定量RT-PCR和Western blot 验证 StAR、CYP11A1 和 3β-HSD 的表达。4.TM3细胞实验:GRIM-19siRNA转染TM3细胞,ELISA检测转染细胞上清液中的睾酮激素水平,定量RT-PCR和Western blot验证StAR、CYP11A1和3β-HSD的表达。5.机制研究:转染siRNA下调TM3细胞GRIM-19表达,通过RT-PCR检测,筛选mRNA差异表达的Notch信号相关分子。分别将表达变化的相关分子的siRNA转染至TM3 细胞,RT-PCR 和 Western blot 检验 StAR、CYP11A1 和 3β-HSD mRNA 和蛋白的表达,研究GRIM-19发挥作用的信号转导途径。研究结果:1.GRIM-19+/-小鼠精子数量和活力明显降低,睾丸结构异常。（1）与WT小鼠相比,GRIM-19+/-小鼠睾丸形状和重量没有差异,GRIM-19+/-小鼠精子数量减少（P=0.0191）,精子前向运动比率（P＜0.0001）和精子活动率（P=0.0397）降低。（2）两组小鼠精子形态没有明显差异。（3）GRIM-19+/-小鼠睾丸组织中的曲细精管结构完整,但管腔内各级生精细胞排列稀疏,细胞间隙变大,小鼠附睾组织管腔排列紧密,细胞形态正常。（4）GRIM-19+/-小鼠精子的线粒体膜电位降低（P=0.0015）,活性氧含量增加（P=0.0047）,凋亡细胞明显增多（P=0.0258）。2.GRIM-19+/-小鼠睾丸组织中睾酮和类固醇合成相关蛋白的表达降低。（1）GRIM-19主要分布于睾丸生精小管间质。（2）免疫组化显示GRIM-19+/-小鼠睾丸中CYP11A1（P＜0.0001）和3β-HSD（P=0.0007）的水平降低。（3）GRIM-19+/-小鼠睾丸中GRIM-19（P=0.0929）、StAR（P=0.0006）、CYP11A1（P=0.0131）、3β-HSD（P=0.0002）mRNA的表达降低,StAR（P=0.0009）、CYP11A1（P=0.0246）和 3β-HSD（P=0.0128）蛋白表达降低。3.在GRIM-19+/-小鼠原代Leydig细胞中,类固醇合成相关蛋白的表达降低。（1）GRIM-19（P=0.0023）、StAR（P=0.0313）、CYP11A1（P=0.0194）和 3β-HSD（P=0.0742）mRNA在GRIM-19+/-小鼠中降低,17β-HSD表达无统计学差异。（2）GRIM-19（P=0.0097）缺陷的 Leydig 细胞中 StAR（P=0.0023）、CYP11A1（P=0.0087）和 3β-HSD（P=0.0073）蛋白表达降低。4.TM3细胞中GRIM-19表达的下调会降低睾酮和类固醇合成相关蛋白的表达。（1）GRIM-19siRNA 可有效下调 TM3 细胞中的 GRIM-19 表达（P=0.0065）。（2）GRIM-19siRNA下调组细胞上清液中睾酮激素水平降低（P=0.0197）。（3）与对照组相比,GRIM-19siRNA 组 StAR（P=0.0189）、CYP11A1（P=0.0011）和 3β-HSD（P=0.0004）的 mRNA 表达降低。（4）Western blot 检测,GRIM-19siRNA 组 StAR（P=0.0421）、CYP11A1（P=0.0092）和 3β-HSD（P=0.0482）蛋白表达低于对照组。5.Notch信号通路参与了 GRIM-19介导的睾酮合成。（1）Notch4（P＜0.0001）、Delta3（P=0.0029）、Delta4（P＜0.0001）、Jagged1（P=0.0006）和 Jagged2（P=0.0057）mRNA 在 TM3 细胞 GRIM-19siRNA 组中表达降低。（2）分别将 Notch4、Delta3、Delta4、Jagged1、Jagged2 siRNA 转染至 TM3 细胞,Delta3siRNA 组（P=0.0396）CYP11A1（P=0.0017）和3β-HSD（P＜0.0001）的 mRNA 降低,StAR 的 mRNA 表达无统计学差异。Delta3siRNA组 CYP11A1（P=0.0002）和 3β-HSD（P＜0.0001）蛋白表达低于对照组,而StAR表达没有统计学差异。Delta4siRNA组（P=0.0086）中StAR（P=0.0002）、CYP11A1（P=0.0011）和 3β-HSD（P=0.0458）的 mRNA 表达降低,Delta4siRNA 组 StAR（P=0.0039）、CYP11A1（P=0.0495）、3β-HSD（P=0.005）蛋白表达量低于对照组。Notch4、Jagged1、Jagged2 siRNA 转染 TM3 细胞后,StAR、CYP11A1、3β-HSD表达无统计学差异。研究结论:1.GRIM-19表达下调可导致精子数量和活力降低。2.GRIM-19可通过精子线粒体膜电位、活性氧水平及凋亡水平,影响精子活力。3.GRIM-19可能在一定程度上通过Notch信号通路调节睾酮和类固醇激素的合成。