【摘 要】
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目的:巨噬细胞在机体炎症反应中扮演着重要角色,一般在炎症前期主要极化为促炎M1型,启动免疫反应杀伤病原体,在炎症后期极化为抑炎M2型,介导修复作用降低炎症反应。STAT家族蛋白在调控巨噬细胞极化中起着关键作用,其具体的调控机制还有待进一步明确。Cdc42是Rho家族的小分子GTP酶。Cdc42可通过调控STAT家族的磷酸化影响癌症的发展进程。研究表明,Cdc42参与机体炎症反应,但Cdc42对巨噬
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目的:巨噬细胞在机体炎症反应中扮演着重要角色,一般在炎症前期主要极化为促炎M1型,启动免疫反应杀伤病原体,在炎症后期极化为抑炎M2型,介导修复作用降低炎症反应。STAT家族蛋白在调控巨噬细胞极化中起着关键作用,其具体的调控机制还有待进一步明确。Cdc42是Rho家族的小分子GTP酶。Cdc42可通过调控STAT家族的磷酸化影响癌症的发展进程。研究表明,Cdc42参与机体炎症反应,但Cdc42对巨噬细胞极化的影响目前尚未见报道。本研究旨在探究Cdc42在巨噬细胞极化中的作用及其分子机制,为精准调控促炎/抑炎反应进程,防治炎症性疾病提供有力的依据。方法:1.髓系细胞特异性敲除Cdc42小鼠的建立及鉴定。利用Cdc42 Flox小鼠与髓系特异性表达Cre重组酶的Lyz2cre小鼠交配,PCR鉴定子代小鼠基因型,分别得到带有Lyz Cre的Cdc42-Flox（F/F+）髓系特异性敲除Cdc42的实验组小鼠和不带Cre的对照组Cdc42-Flox（F/F-）小鼠。2.分离提取小鼠腹腔巨噬细胞,采用罗丹明标记的鬼笔环肽进行F-ACTIN染色,荧光显微镜下观察LPS刺激前后细胞形态的变化。3.ML141抑制Cdc42活性后,RT-q PCR检测RAW264.7巨噬细胞中LPS介导的M1型极化相关的细胞因子水平;流式细胞术检测THP-1细胞LPS介导的M1型表面标志物CD64的分布情况。4.分离提取小鼠腹腔巨噬细胞,检测LPS刺激后NF-κB及IRF3信号通路激活情况;ML141抑制THP-1细胞Cdc42活性后,检测LPS介导的STAT家族及SOCS3等蛋白的表达情况。5.利用APXE2/MS技术和REACTOME信号通路分析筛选与Cdc42相互作用的可能影响先天免疫和巨噬细胞极化的功能性蛋白质分子。在细胞水平,利用Co-IP实验进一步验证筛选出的蛋白质分子与Cdc42之间的相互作用。6.采用免疫荧光实验检测所筛选出的蛋白质分子与Cdc42在LPS激活的巨噬细胞中的相互作用关系。结果:1.缺失Cdc42抑制小鼠腹腔巨噬细胞向LPS介导的M1型样形态转化。2.抑制Cdc42活性明显减少M1型巨噬细胞相关因子TNFα、IL-1β及SOCS3的转录表达;流式细胞术结果显示,Cdc42缺失明显减少巨噬细胞向M1方向极化。3.Cdc42缺失明显抑制巨噬细胞中LPS介导的NF-κB及IRF3信号通路的激活。4.抑制Cdc42活性明显减少LPS介导的STAT1的激活以及SOCS3的表达。5.APEX2/MS技术筛选出与Cdc42相互作用蛋白质分子ANXA2,并在HEK293T细胞中验证了ANXA2与Cdc42之间的相互作用。6.Cdc42可能通过与ANXA2相互作用影响STAT1激活,进而调控巨噬细胞的M1型极化。结论:Cdc42的缺失明显抑制巨噬细胞向M1型极化。我们的实验结果表明,Cdc42可能通过影响ANXA2与STAT1之间的相互作用进而影响STAT1调节巨噬细胞的M1型极化,Cdc42/ANXA2/STAT1可能作为功能性复合体在巨噬细胞极化中发挥作用,影响下游炎症因子TNFα、IL-1β的表达以及转录因子NF-κB的活化,参与巨噬细胞炎症反应。
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