论文部分内容阅读
研究背景和目的慢性萎缩性胃炎（Chronic atrophic gastritis,CAG）,是一种常见的以胃腺体萎缩、胃腺体数量减少和慢性炎症为特征的消化道疾病。幽门螺杆菌感染、吸烟、饮酒和免疫异常都可能导致CAG的发展,其中幽门螺杆菌（H.pylori）感染是主要致病因素。幽门螺杆菌的细胞毒素相关基因A（Cag A）和空泡毒素（Vac A）两个毒力因子可导致胃粘膜内持续存在炎症反应,并产生过多氧自由基,导致DNA损伤甚至进展至胃癌。此外,CAG是胃癌的癌前状态,在其缓慢进展的过程中,胃酸浓度下降,从而胃内杀菌能力减弱,致使胃内菌群发生剧烈改变,最终导致肠道菌群结构改变、破坏肠粘膜。因此,及时有效地治疗CAG可预防GC的发生。CAG的常规治疗包括质子泵抑制剂、抗生素等药物,但现阶段临床中缺乏可逆转CAG患者胃萎缩的特异性药物。抗坏血酸（Ascorbic acid,AA）,即维生素C（Vitamin C）,是一种抗氧化剂,主要存在于新鲜水果蔬菜中。AA被认为可以通过影响H.pylori感染而降低胃炎、十二指肠溃疡和癌症等相关胃部疾病的发生率。研究表明,AA的作用机制主要包括减少胃液中N-亚硝胺化合物的形成及清除氧自由基。瑞巴派特（Rebamipide）是一种胃粘膜保护剂,主要应用于胃溃疡和胃炎等消化道疾病的诊治,具有抗炎和抑制胃癌细胞生长的作用。一项随机对照研究表明,瑞巴派特对于改善CAG和肠上皮化生有重要作用[17]。为进一步明确抗坏血酸及瑞巴派特改善胃黏膜萎缩情况及机制研究,同时探讨二者对肠道菌群的影响。本研究利用幽门螺杆菌建立萎缩性胃炎动物的模型,探讨抗坏血酸、瑞巴派特、慢性萎缩性胃炎、氧化应激、肠道菌群之间可能存在的联系。实验方法以4周龄、C57BL/6雄性小鼠为实验对象,随机分为对照组、模型组（萎缩性胃炎模型）、抗坏血酸组及瑞巴派特组（n1=10,n2、3、4=15）,除对照组无任何干预措施外,其余三组交替给予幽门螺杆菌灌胃和亚硝酸盐溶液（MNU）自由饮用,MNU隔一周一次,在未MNU给药期间,给予幽门螺杆菌悉尼菌株（Helicobacter pylori Sydney Strain 1,H.pylori SS1）灌胃连续间断处理6周,给药结束后继续灌菌处理4周。灌胃结束,干预组分别给予抗坏血酸溶液（0.5 g/L）和瑞巴派特溶液（100mg/kg）自由饮用12周。期间,注意小鼠体重、活动及精神状态。结束后,处死小鼠,并取血清及胃组织,通过Hp免疫组化明确hp定植情况;H＆E染色法观察小鼠胃粘膜病变程度;通过RT-q PCR检测胃组织炎症因子、抗氧化通路相关基因Nrf-2、HO-1、NQO-1的m RNA表达水平,检测胃内氧化应激因子和抗氧化应激因子水平以及通过测序检测肠道菌群及其变化。实验结果1.免疫组化结果示,H.pylori-SS1在小鼠胃内成功定植;2.H＆E染色结果示,与对照组比较,模型组小鼠胃组织出现胃粘膜萎缩,表现为粘膜层变薄、腺体数量减少,腺体排列紊乱等;与模型组相比,抗坏血酸组及瑞巴派特组小鼠胃粘膜层变薄减轻,腺体排列较为整齐;3.H.pylori感染后胃粘膜功能降低,胃泌素、生长抑素和H+/K+ATP酶表达下降（P＜0.05）;与模型组相比,各干预组中胃组织中胃泌素、生长抑素和H+/K+ATP酶表达增加（P＜0.05）;4.q PCR检测Nrf2/、HO-1及NQO-1的m RNA水平,结果显示:模型组中Nrf2、HO-1、NQO-1表达量均有不同程度的降低（P＜0.05）;与模型组相比,各干预组中三者m RNA表达有不同程度的升高（P＜0.05）;5.进一步检测胃组织中氧化和抗氧化变化,结果显示:模型组中胃内MDA活力及MPO含量增加,而总SOD活力及CAT含量不同程度的降低（P＜0.05）;与模型组相比,各干预组降低MDA活力及MPO含量,增加总SOD活力（P＜0.05）,抗坏血酸组中CAT含量增加（P＜0.05）,瑞巴派特组中对CAT含量差异无统计学意义（P＞0.05）;6.q PCR检测炎症因子的m RNA水平,结果显示:H.pylori感染显著增加IFN-γ、IL-1β、TNF-α以及IL-6等促炎因子的m RNA表达,IL-4和IL-10等抑炎因子的m RNA表达不同程度降低（P＜0.05）;与模型组相比,各干预组中降低促炎因子的m RNA表达,以及升高抑炎因子的m RNA表达（P＜0.05）;7.菌群结果分析:H.pylori感染增加小鼠肠道内菌群丰富度以及改变肠道菌群结构;抗坏血酸及瑞巴派特可改善肠道菌群结构,调节Firmicutes与Bacteroidetes比例失衡,使肠道微生物群结构趋于正常,保护肠粘膜。结论1、抗坏血酸及瑞巴派特通过Nrf-2/HO-1、NQO-1抗氧化应激通路减轻粘膜氧化应激反应,调节氧化和抗氧化平衡,并通过下调胃内Th1免疫反应,促进Th2型反应的抗炎因子的表达,从而抑制胃内炎症反应,同时进一步改善胃粘膜萎缩及胃粘膜功能;2、幽门螺杆菌所致萎缩性胃炎小鼠肠道菌群丰富度发生改变,肠道菌群结构紊乱,抗坏血酸及瑞巴派特能够调节菌群结构趋于正常,增加有益菌丰度,保护肠粘膜。