猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是近年新发现的一种能引发猪肠道疾病的冠状病毒，临床症状表现为脱水、腹泻、呕吐等。PDCoV可感染不同年龄阶段的猪，仔猪的感染率和死亡率均较高。PDCoV在多个国家和地区的腹泻猪临床样本中都能被检测到，自暴发以来给养猪业造成了巨大损失。目前，针对PDCoV的疫苗和抗体药物亟待开发。单链抗体(Single-chain variable fragment antibody，scFv)是一种基因工程抗体，以其分子量小，穿透力强以及易于基因工程操作等优点，近些年来被广泛应用于免疫诊断、抗病毒、靶向治疗等多个领域。目前，scFv主要通过噬菌体抗体展示技术来获得，该技术不需要细胞融合，抗体基因利用简单的PCR扩增就可以得到，且可以与噬菌体外壳蛋白基因融合表达，展示在噬菌体表面，大大降低了操作难度。本研究利用噬菌体展示技术构建了猪源噬菌体单链抗体库，通过四轮筛选获得了能与PDCoVN蛋白特异性结合的噬菌体scFv，并对筛选到的scFv进行了真核表达，对其活性进行了验证，以期为该病毒的免疫检测和防治奠定一定的基础。具体研究内容如下:
　　1.PDCoV猪源噬菌体单链抗体库的构建
　　从感染PDCoV的猪脾脏中提取RNA，并反转录获得cDNA，以此为模板扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，并利用重叠延伸PCR将其拼接为scFv基因。将scFv基因克隆至噬菌粒质粒pSEX81后，电转化XL1-Blue感受态细胞，构建猪源单链抗体基因文库。经测算，VH-VLκ累积库容约为6.5×107cfu/mL，VH-VLλ累积库容约为1.7×108cfu/mL，经PCR鉴定插入基因片段大小的正确率约为80％。使用辅助噬菌体M13KO7侵染初级基因文库，构建噬菌体单链抗体初级库，滴度为4.5×109pfu/mL。
　　2.抗PDCoVN蛋白单链抗体的富集与筛选
　　为了得到针对PDCoVN蛋白的特异性scFv，以原核表达的N蛋白为靶蛋白包被ELISA板，采用微孔板筛选法对抗体库进行4轮富集筛选以富集特异性噬菌体抗体，最终抗体库的富集倍数约为310倍。从第四轮筛选的平板上随机挑取84个单菌落进行PCR鉴定，其中阳性克隆为11个，经测序及序列比对分析，符合抗体可变区基因结构且无终止密码子的共有5个，最终经phage-ELISA验证得到3株亲和力较高的噬菌体抗体，分别为scFv-25、scFv-27和scFv-53。
　　3.特异性单链抗体的表达和活性检测
　　为了得到有活性的scFv，将筛选得到的scFv基因克隆到真核表达载体pFUSE-hIgG-Fc2上，经测序验证后转染至293T细胞进行真核表达，最终成功表达两个scFv，并利用ProteinA对其进行纯化。ELISA结果显示两株抗体都能与PDCoV反应而不与其他猪常见病毒反应，表明抗体特异性良好;Westernblot结果显示所表达抗体可以与PDCoV反应;间接免疫荧光试验(IFA)显示两株抗体都能特异性识别PDCoV。以上试验结果表明所表达scFv具有良好的特异性和结合力。
　　综上所述，本研究构建了PDCoV猪源噬菌体抗体库，并从中筛选且成功表达了2株抗PDCoVN蛋白的scFv，为PDCoV的治疗和防治提供了一定的思路。