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稻曲病是由稻曲菌(Ustilaginoidea virens)侵染引起的水稻穗部病害,在世界水稻种植区广泛发生。稻曲病不仅影响水稻产量,病菌产生的毒素还直接威胁人类健康。目前对稻曲菌的致病机理以及抗稻曲病资源挖掘研究报道较少。本研究对稻曲菌3个致病因子UvPal1、Uv CGBP1和Uv Sec117的致病机理进行了研究,并通过寄主诱导的基因沉默(HIGS)创建了抗稻曲病水稻新材料。主要研究结果如下:(1)解析了细胞形态蛋白UvPal1的致病机制。在实验室前期构建的T-DNA插入突变体库中,筛选到了一株影响稻曲菌细胞形态和致病力的突变体T184,TDNA序列插入UvPal1基因的第四个外显子上。对UvPal1基因进行敲除和互补,发现UvPal1基因敲除突变体生长减慢,细胞形态异常,压力响应变化以及致病力完全丧失。使用酵母双杂交从稻曲菌文库中筛选到互作蛋白Uv Cdc11,酵母双杂交、双分子荧光互补实验(Bi FC)以及免疫共沉淀(Co-IP)证明UvPal1和隔膜蛋白Uv Cdc11在细胞质互作。Uv Cdc11蛋白在野生型菌株HWD-2中定位于细胞质和隔膜,但是在UvPal1基因敲除突变体中Uv Cdc11蛋白大量聚集定位于液泡,表明UvPal1影响Uv Cdc11的蛋白定位。Uv Cdc11是Septin复合体中的核心蛋白,酵母双杂交证明Uv Cdc11与其他三个核心的Septin蛋白(Uv Cdc3,Uv Cdc10和Uv Cdc12)之间相互作用形成一个复合体。分别对这四个Septin基因进行敲除和互补,发现Septin基因敲除突变体在分生孢子和菌丝形态、压力响应以及致病力均表现严重的缺陷。Septin基因敲除突变体表型与UvPal1基因敲除突变体相似,表明UvPal1通过与隔膜蛋白Uv Cdc11互作,进而调控Septin复合体去影响稻曲菌的细胞形态、压力响应和致病力。(2)揭示了稻曲菌C2H2型转录因子Uv CGBP1的致病机制。对Uv CGBP1基因进行敲除和互补,发现Uv CGBP1基因敲除突变体菌丝生长减慢,生物量和产孢量降低,色素增加,对环境压力胁迫的耐受性发生变化,致病力完全丧失。Uv CGBP1亚细胞定位于细胞核中。使用Ch IP-seq技术鉴定Uv CGBP1直接结合的865个靶基因,分别参与转录因子复合体,转录因子活性,转录,信号转导和蛋白质磷酸化等。KEGG富集分析表明Uv CGBP1靶基因显著富集MAPK和苯甲酸代谢通路。RNA-seq和Ch IP-seq联合分析鉴定了Uv CGBP1结合调控的576个差异表达基因,36%差异表达靶基因的启动子区域含有G-box motif,表明Uv CGBP1结合Gbox motif去调控基因的表达。通过Ch IP-PCR、酵母单杂交和凝胶迁移实验(EMSA)证明Uv CGBP1可直接结合MAPK通路激酶Uv Slt2和Uv Pmk1基因启动子区域。与野生型菌株HWD-2相比,ΔUv CGBP1-33突变体中Uv Slt2和Uv Pmk1基因和蛋白的表达量降低,表明Uv CGBP1调控Uv Slt2和Uv Pmk1基因的表达。在ΔUv CGBP1-33突变体中超表达Uv Slt2和Uv Pmk1基因,发现超表达Uv Pmk1基因能部分恢复ΔUv CGBP1-33突变体的菌丝生长和致病力,表明Uv CGBP1调控Uv Pmk1影响稻曲菌的致病力和菌丝生长。因此,Uv CGBP1通过调控Pmk1-MAPK信号途径从而影响菌丝生长以及致病力。(3)揭示了稻曲菌效应子Uv Sec117的致病机制。从稻曲菌摇培液中鉴定了一个分泌蛋白Uv Sec117,Uv Sec117包含一个信号肽(SP),酵母分泌活性试验证明其信号肽具有分泌活性。大量表达Uv Sec117能够抑制Bax诱导的细胞过敏性坏死,表明效应子Uv Sec117可以抑制植物的免疫反应。对Uv Sec117基因进行敲除和互补,发现Uv Sec117基因敲除突变体的致病力减弱。Uv Sec117亚细胞定位于烟草细胞的细胞核和细胞质。使用酵母双杂交从水稻文库中筛选到互作蛋白组蛋白去乙酰化酶Os HDA701,进一步使用酵母双杂交、Co-IP、Bi FC以及GST pull-down证明Uv Sec117和Os HDA701在细胞核和细胞质互作。Os HDA701基因沉默后,对稻曲病、稻瘟病和白叶枯病的抗性增强,表明Os HDA701广谱负调控水稻的抗病性。Os HDA701亚细胞定位于细胞核和细胞质,并且大量块状聚集定位在液泡中。当Uv Sec117和Os HDA701共表达烟草细胞时,Os HDA701块状聚集在液泡中的荧光信号消失,并且Os HDA701在细胞核的含量明显增加,表明Uv Sec117会影响Os HDA701蛋白定位,招募更多的Os HDA701蛋白进入细胞核。将Os HDA701和Uv Sec117蛋白原核纯化后,体外孵育试验证明Os HDA701可以清除组蛋白H3K9乙酰化修饰,并且Uv Sec117增强Os HDA701清除组蛋白H3K9乙酰化修饰的能力。使用HDAC组蛋白去乙酰化酶活性荧光分析试剂盒对Os HDA701酶活进行测定,发现Uv Sec117增强Os HDA701去乙酰化酶的活性。Uv Sec117异源超表达转基因水稻(35S-Uv Sec117)对稻曲病、稻瘟病和白叶枯病抗性显著减弱,并且35SUv Sec117转基因水稻感病性增强与H3K9乙酰化修饰相关,使用Ch IP-seq鉴定35SEV(空载对照)和35S-Uv Sec117转基因水稻中H3K9乙酰化修饰调控的靶基因。35S-EV转基因水稻中鉴定了28394个靶基因,而35S-Uv Sec117转基因水稻中鉴定了831个靶基因,35S-Uv Sec117转基因水稻中H3K9乙酰化修饰调控的靶基因数量显著减少,RT-q PCR和Ch IP-PCR证明35S-Uv Sec117转基因水稻中H3K9乙酰化修饰调控抗病相关基因的表达量显著降低,表明Uv Sec117通过影响组蛋白H3K9乙酰化修饰调控抗病相关基因的表达影响水稻的免疫。本研究结果表明Uv Sec117和Os HDA701互作,Uv Sec117招募更多的Os HDA701定位于细胞核,进而清除组蛋白H3K9乙酰化修饰,影响组蛋白H3K9乙酰化修饰调控抗病基因的表达,进而影响水稻的抗病性。(4)HIGS技术创建抗稻曲病新材料。通过比较基因组学方法在稻曲菌基因组中选择真菌特有的致病因子Uv Asp E、Uv Com1、Uv Pro1和Uv Sec117作为HIGS的靶基因,分别构建Uv Asp ERNAi、Uv Com1RNAi、Uv Pro1RNAi和Uv Sec117RNAi转基因水稻株系。T3代转基因水稻接种后产生少量的稻曲球,表明转基因水稻对稻曲病的抗性显著增强且持久稳定。RT-q PCR检测结果表明Uv Asp E、Uv Com1、Uv Pro1和Uv Sec117基因的表达量在侵染RNAi转基因水稻过程中显著降低,small RNA-seq数据分析表明RNAi转基因水稻产生大量靶向Uv Asp E、Uv Com1、Uv Pro1和Uv Sec117基因的si RNA。荧光原位杂交(FISH)证明RNAi转基因水稻植株产生的si RNA分子被转移到侵染的稻曲菌菌丝中,导致靶基因转录水平下降,RNAi转基因水稻表现为抗病。本研究从细胞形态蛋白UvPal1、转录因子Uv CGBP1和效应子Uv Sec117三类不同的致病因子的角度探讨了稻曲菌的致病机制。丰富对稻曲菌的致病机理以及稻曲菌和水稻互作机理的认识,并提出了通过HIGS技术创建抗稻曲病新材料和新策略。