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干旱是制约棉花生长的重要非生物逆境因素,严重影响棉花的产量和品质。植物在长期进化过程中形成了各种信号网络和调控机制来应对各种非生物胁迫。Ca2+是细胞内信号转导重要的第二信使,干旱等逆境胁迫引起的钙信号能被钙感受器感知并解码后进行信号转导。已有研究表明,CBL-CIPK介导的钙信号转导参与植物多种逆境胁迫响应,但其研究大都集中在模式植物中,棉花中关于CBL-CIPK信号通路在干旱胁迫响应中的功能有待进一步挖掘。本研究系统鉴定了陆地棉中的CBL和CIPK家族基因及两个家族蛋白间的相互作用模式;进一步在棉花中鉴定到GhCBL1A1-GhCIPK6D1参与棉花对干旱胁迫的调节,并对其作用机制进行了解析,结果如下:1.陆地棉GhCBL和GhCIPK基因家族的鉴定、互作模式及表达分析本研究通过将拟南芥中的10个At CBLs和26个At CIPKs蛋白序列与陆地棉参考基因组TM-1数据库进行序列比对,在陆地棉中共鉴定到22个GhCBLs和79个GhCIPKs基因。结果表明,GhCBLs聚类成4个亚家族,GhCIPKs聚类成3个亚家族;GhCBLs都具有能够结合Ca2+的EF手环,绝大部分GhCIPKs都具有能够结合CBL的NAF结构域;绝大多数的GhCBLs和GhCIPKs在A亚基因组和D亚基因组中均存在一一对应的同源拷贝。酵母点对互作结果表明,GhCBL1亚家族蛋白能够与多个CIPK1亚家族成员存在互作,且一个GhCBL可以和多个GhCIPKs存在互作。此外,多个GhCBL1和GhCIPK6亚家族成员受干旱诱导差异表达,包括本研究的GhCBL1A1和GhCIPK6D1基因。2.GhCIPK6D1负调控棉花抗旱性GhCIPK6D1调控棉花抗旱性。超表达GhCIPK6D1植株对干旱胁迫更敏感,而CRISPR-Cas9介导的GhCIPK6D1突变体植株表现抗旱。在正常生长状态下,各个材料间的脯氨酸含量、MDA含量和H2O2含量都没有显著差异,在干旱处理后,超表达植株的脯氨酸含量显著低于野生型,而敲除突变体的脯氨酸含量则显著高于野生型。超表达株系的MDA含量和H2O2含量都显著高于野生型,而敲除突变体都显著低于野生型。GhCIPK6D1超表达植株和敲除突变体在蒸腾和离体叶片失水率上存在显著差异,敲除突变体相对于野生型和超表达植株,有较高的相对含水量,较低的蒸腾速率和较慢的离体叶片失水速率。利用扫描电镜对干旱处理前后的转基因材料和野生型材料进行了气孔开度的观察,以及气孔密度的统计。结果表明,在干旱处理前,各材料间的气孔开度和密度均没有显著性差异。在干旱处理后,与野生型相比,超表达植株的气孔开度增大,敲除突变体的气孔开度减小,而三者在气孔密度上并无显著差异,说明GhCIPK6D1可能通过负调控气孔的开度来响应植株的抗旱性。进一步研究表明,与野生型植株相比,超表达GhCIPK6D1促进保卫细胞K?内流,植株敏旱;敲除突变体则表现为K?外排的趋势,植株抗旱。3.GhCBL1A1-GhCIPK6D1协同负调控棉花抗旱性通过酵母双杂交实验筛选到与GhCIPK6D1互作的GhCBL1A1蛋白。通过双分子荧光互补实验（Bi FC）和Pull-down实验对GhCIPK6D1和GhCBL1A1在体内体外的互作进行了验证。VIGS介导的GhCBL1A1的沉默能够提高植株的抗旱性。在超表达GhCIPK6D1背景下沉默GhCBL1A1能有效减小气孔的开度,回复超表达GhCIPK6D1敏旱的表型;而在GhCIPK6D1敲除突变体背景下沉默GhCBL1A1气孔开度会进一步减小,棉花表现更抗旱,说明GhCBL1A1-GhCIPK6D1通过协同负调控干旱处理下棉花气孔开度来增强棉花的抗旱性。4.GhSKD1可能作为GhCIPK6D1下游靶标参与棉花抗旱性调节通过酵母双杂交筛库,鉴定到GhCIPK6D1与钾离子生长转运缺陷抑制因子GhSKD1互作。通过Bi FC和Pull-down实验证实了GhCIPK6D1与GhSKD1在体内及体外的互作。表达模式分析表明GhSKD1受干旱诱导上调表达。干旱条件下沉默GhSKD1,与对照相比降低了植株的抗旱性,并且气孔开度变大,表明GhSKD1正调控棉花的抗旱性。说明GhCBL1A1-GhCIPK6D1信号系统可能通过调控GhSKD1蛋白来调控棉花抗旱性。5.GhCBL1A1和GhCIIPK6D1在自然群体中存在抗旱性相关的自然变异选取课题组筛选的抗旱材料ZY168和敏旱材料ZY7对GhCBL1A1和GhCIPK6D1进行表达分析,发现GhCBL1A1和GhCIPK6D1在抗旱和敏旱材料中的表达存在显著差异。因此,对GhCBL1A1和GhCIPK6D1在517份棉花自然群体中进行变异分析,发现在GhCBL1A1启动子区和基因编码区存在抗旱性相关的自然变异,启动子区的变异可能影响基因的表达;在GhCIPK6D1编码区存在2个与抗旱性相关联的SNP,且该SNP变异导致了氨基酸的变化,可能影响GhCIPK6D1蛋白激酶的磷酸化位点活性。综上所述,本研究在棉花上鉴定到的GhCBL1A1-GhCIPK6D1信号通路参与调控棉花抗旱性的响应,为改良棉花抗旱性提供新基因资源,为丰富作物逆境响应机制提供新见解。