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目的肿瘤干细胞是具有自我更新和分化能力的肿瘤细胞亚群,在卵巢癌化疗耐药及复发中发挥重要作用。本研究旨在探究HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA,HOTAIR）对卵巢癌干细胞（ovarian cancer stem cells,OCSCs）的调控作用及机制。方法一.HOTAIR对OCSCs的调控作用研究1.流式分选从卵巢癌细胞系（ES2、SKOV3）和原代卵巢癌细胞中获得乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase,ALDH）活性较高的ALDHbr（ALDHbright）细胞及活性较低的ALDHdi（ALDHdim）细胞,对卵巢癌细胞OVCAR3进行悬浮培养获得球形体细胞OVCAR3-sphere,OCSCs富集于ALDHbr细胞及OVCAR3-sphere中。2.定量实时聚合酶链式反应（quantitative Real Time-polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测ALDHbr及ALDHdi细胞中干性相关因子SOX2、NANOG、OCT4、KLF4的表达水平,悬浮成球实验检测细胞成球能力,CCK-8法检测细胞顺铂耐药能力。3.qRT-PCR检测HOTAIR在ALDHbr细胞和ALDHdi细胞以及OVCAR3-sphere和OVCAR3亲本细胞（OVCAR3-parent）中的表达水平。4.构建携带靶向HOTAIR的短发夹RNA（short hairpin RNA,sh RNA）和HOTAIR过表达质粒的慢病毒（分别命名为LV-sh HOTAIR和LV-HOTAIR）,转染并筛选HOTAIR稳定下调或过表达的细胞株。5.在ALDHbr细胞中稳定下调HOTAIR后,q RT-PCR检测干性相关因子SOX2、NANOG、OCT4、KLF4的表达水平,悬浮成球实验检测成球能力,构建裸鼠皮下移植瘤模型,根据成瘤率及成瘤大小评价细胞成瘤能力,免疫组化检测移植瘤内增殖相关分子ki67、干细胞表面标志物CD44的表达,CCK-8法检测细胞顺铂耐药能力;q RT-PCR检测经顺铂处理的ALDHbr细胞中HOTAIR的表达水平。二.HOTAIR对OCSCs的调控机制研究1.借助MEM网站得到与HOTAIR表达具有相关性的基因,查阅既往文献,从中挑选出与干性相关的基因,q RT-PCR及蛋白质免疫印迹实验（western blot）检测它们在卵巢癌细胞中与HOTAIR表达的相关性,以及它们在ALDHbr细胞、ALDHdi细胞和OVCAR3-sphere、OVCAR3-parent细胞中的表达水平,最终筛选出可能的下游靶基因。2.免疫组化检测移植瘤中T-box转录因子3（T-box transcription factor 3,TBX3）及其下游靶基因PTEN的表达;收集卵巢癌患者的病灶组织,q RT-PCR检测其中HOTAIR及TBX3的水平,并分析其相关性。3.将小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）转染至ALDHbr细胞中下调TBX3,q RT-PCR检测干性相关因子SOX2、NANOG、OCT4、KLF4的表达,悬浮成球实验检测细胞成球能力,CCK-8法和克隆形成实验检测细胞顺铂耐药能力;将过表达质粒转染至OVCAR3细胞中使TBX3过表达,悬浮成球实验检测细胞成球能力。4.向稳定下调HOTAIR的ALDHbr细胞中转染质粒使TBX3过表达,悬浮成球实验检测细胞成球能力。三.miR-206/TBX3轴在HOTAIR对OCSCs调控中的作用研究1.miRTar Base,miRWalk,Target Scan以及miRDB预测与TBX3 m RNA具有结合潜力的miRNA集,miRcode预测与HOTAIR具有结合潜力的miRNA集,将五个数据集取交集。2.在ALDHbr细胞中稳定下调HOTAIR后,q RT-PCR检测miR-206的表达水平。3.将miR-206 mimic转染至ALDHbr细胞中使miR-206过表达,q RT-PCR检测TBX3的表达水平。4.在ALDHbr细胞中稳定下调HOTAIR后,使用miR-206 inhibitor同步下调miR-206,q RT-PCR及western blot检测TBX3的表达水平。5.构建载有TBX3 m RNA的3’-UTR区野生序列或在miR-206结合位点处突变的突变序列的双荧光素酶报告载体,将载体及miR-206 inhibitor共同转入稳定下调HOTAIR的ALDHbr细胞中,检测荧光素酶活性。6.qRT-PCR比较miR-206在ALDHbr细胞和ALDHdi细胞以及OVCAR3-sphere和OVCAR3-parent细胞中的表达水平。7.将miR-206 mimic转染至ALDHbr细胞中使miR-206过表达,q RT-PCR检测干性相关因子NANOG的表达水平,悬浮成球实验检测细胞成球能力,CCK-8法和克隆形成实验检测细胞顺铂耐药能力;将miR-206 inhibitor转染至OVCAR3细胞中,悬浮成球实验检测细胞成球能力。8.在ALDHbr细胞中下调HOTAIR及抑制miR-206后,悬浮成球实验检测细胞成球能力,CCK-8法检测细胞顺铂耐药能力。四.血浆HOTAIR在卵巢癌中的临床意义研究收集良性或恶性卵巢上皮性肿瘤患者的外周血标本,q RT-PCR检测血浆中HOTAIR的表达水平,通过构建受试者工作曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分析其区分良恶性肿瘤的效能,并用Fisher’s精确检验分析其与卵巢癌患者临床病理特征的相关性。结果一.HOTAIR促进OCSCs的干性1.与ALDHdi细胞相比,ALDHbr细胞中干性相关因子SOX2、NANOG、OCT4、KLF4的表达水平更高,成球能力及顺铂耐药能力更强。2.HOTAIR在ALDHbr细胞和OVCAR3-sphere中的表达水平分别高于ALDHdi细胞和OVCAR3-parent细胞。3.HOTAIR的下调导致ALDHbr细胞中SOX2、NANOG、OCT4、KLF4的表达水平下降,成球能力、成瘤能力及顺铂耐药能力减弱,移植瘤中ki67及CD44的表达下降;经顺铂处理的ALDHbr细胞中HOTAIR表达水平升高。二.TBX3介导HOTAIR对OCSCs的调控作用1.在25个与HOTAIR表达相关性最强的基因中,我们通过查阅文献筛选出6个与干性相关的基因。在稳定下调HOTAIR的SKOV3-ALDHbr细胞中,筛选出的6个基因里只有HOXA10与TBX3的水平下降。为了继续筛选候选基因,我们将其表达水平与细胞干性相结合,结果显示TBX3在ALDHbr细胞和OVCAR3-sphere中的表达水平分别高于ALDHdi细胞和OVCAR3-parent细胞,而HOXA10在ALDHbr细胞中的表达水平未明显高于ALDHdi细胞。进一步的验证显示,在稳定调控HOTAIR表达的ES-ALDHbr细胞及ES2细胞中,也出现了TBX3水平相应的变化,提示TBX3是HOTAIR下游靶基因。2.HOTAIR的下调导致移植瘤中TBX3的表达下降,PTEN的表达增多;卵巢癌组织中HOTAIR与TBX3的表达水平呈正相关。3.下调TBX3后,ALDHbr细胞中干性相关因子NANOG的表达下降,成球能力和耐药能力减弱,而TBX3的过表达则可提高OVCAR3细胞的成球能力。4.TBX3的过表达可以部分逆转HOTAIR下调造成的ALDHbr细胞成球能力减弱。三.HOTAIR通过miR-206/TBX3轴调控OCSCs1.经网站预测,既能被HOTAIR吸附又能靶向结合TBX3 m RNA的miRNA只有miR-206。2.在ALDHbr细胞中下调HOTAIR后,miR-206的表达水平提高。3.在ALDHbr细胞中过表达miR-206后,TBX3的表达水平下降。4.miR-206的抑制可以部分逆转HOTAIR的降低对TBX3表达的抑制作用。5.双荧光素酶报告实验证实HOTAIR可以减少miR-206对TBX3表达的抑制作用。6.miR-206在ALDHbr细胞和OVCAR3-sphere中的表达水平分别低于ALDHdi细胞和OVCAR3-parent细胞。7.过表达miR-206后,ALDHbr细胞中干性相关因子NANOG的表达下降,细胞的成球能力和耐药能力减弱,而miR-206的抑制则可提高OVCAR3细胞的成球能力。8.ALDHbr细胞中,抑制miR-206可以部分逆转HOTAIR的降低对细胞成球能力及顺铂耐药能力的削弱。四.HOTAIR对卵巢癌具有诊断价值血浆HOTAIR对于诊断卵巢癌的ROC曲线下面积为0.867,且高水平的血浆HOTAIR与FIGO（International Federation of Gynecology and Obstetrics）III-IV期及浆液性卵巢癌相关。结论HOTAIR通过解除卵巢癌细胞中miR-206对TBX3的表达抑制维持OCSCs的干性,从而促进肿瘤进展和耐药,且血浆HOTAIR是潜在的卵巢癌诊断指标。