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口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是全世界范围内最常见的口腔癌,目前采用以手术为主结合放射治疗、化学治疗等疗法进行治疗,虽然已取得一些成绩,但是OSCC晚期患者的预后仍不太理想,倘若能够早期发现,则能大大改善患者的远期预后,因此深入研究OSCC发病的分子机制、寻找新的高效的生物标记物是目前急需解决的问题。近年来,研究显示长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)在肿瘤的发生、发展以及转移过程中起重要作用。LncRNA长度一般超过200个核苷酸,不编码蛋白,可以作为一种竞争性内源性RNA(ce RNA)吸附miRNA,从而参与靶基因的表达调控。研究已发现,长链非编码RNA HLA复合体11(LncRNA HCG11)影响并参与多种肿瘤细胞的增殖、浸润和转移等生物学行为,其在口腔中的表达水平及作用机制尚不明确,需要进一步研究。本研究以人口腔鳞状细胞癌组织、口腔鳞癌细胞株以及通过构建裸鼠皮下移植瘤为研究对象,分别应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白印迹实验(Western Blot)、MTT、流式细胞术、免疫荧光技术、双荧光素酶实验、免疫组织化学、裸鼠皮下移植瘤等实验方法,首先分析了口腔鳞状细胞癌癌组织及癌旁正常组织中LncRNA HCG11和蛋白酪氨酸磷酸酶受体S(PTPRS)的表达差异,然后通过体外实验研究抑制或过表达LncRNA HCG11对三种口腔鳞癌细胞株(TSCCA、CAL-27和Fa Du)增殖的影响,并且应用双荧光素酶实验研究了LncRNA HCG11影响口腔鳞癌细胞株增殖能力的潜在机制,并探讨LncRNA HCG11/miR-455-5p分子轴是否能够通过靶向调控PTPRS参与OSCC的发展,最后成功转染稳定抑制LncRNA HCG11的TSCCA细胞株,构建裸鼠皮下移植瘤,观察其在体内对移植瘤生长的影响。通过探讨LncRNA HCG11在口腔鳞状细胞癌增殖中的作用,有助于揭示OSCC的发病机制,同时也为寻找OSCC新的生物标记物奠定基础。第一部分口腔鳞状细胞癌LncRNA HCG11和PTPRS的表达水平研究目的:口腔鳞状细胞癌是口腔恶性肿瘤,其侵袭性强,预后差,生存率低。研究表明LncRNA HCG11和PTPRS在肿瘤的发展和调控中起重要作用。本研究收集口腔鳞状细胞癌患者的癌组织和癌旁正常组织,分别检测LncRNA HCG11和PTPRS的表达水平,分析它们与口腔鳞状细胞癌的关系。方法:1.使用qRT-PCR方法检测癌组织和癌旁正常组织中LncRNA HCG11和PTPRS mRNA的表达水平。2.通过Western Blot检测癌组织和癌旁正常组织中PTPRS蛋白的表达水平。结果:1.qRT-PCR检测癌组织及癌旁正常组织LncRNA HCG11的表达水平癌旁正常组织和癌组织LncRNA HCG11的表达水平分别为0.034±0.008和0.019±0.005。经统计分析,与癌旁组织相比,癌组织中LncRNA HCG11的表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.qRT-PCR检测癌组织及癌旁正常组织PTPRS mRNA的表达水平PTPRS mRNA在口腔癌旁正常组织及癌组织中的表达水平分别为0.100±0.008和0.022±0.002,PTPRS mRNA在癌组织中的表达水平显著下调,有统计学意义(P<0.01)。3.Western Blot检测癌组织及癌旁正常组织PTPRS蛋白的表达PTPRS蛋白在癌旁正常组织和癌组织中的相对表达水平分别为0.974±0.096和0.631±0.153,PTPRS蛋白在癌组织中表达明显降低,差异具有显著性(P<0.01)。小结:1.LncRNA HCG11在癌组织中表达显著低于癌旁正常组织。2.PTPRS mRNA及蛋白在癌组织中表达显著低于癌旁正常组织。3.LncRNA HCG11和PTPRS有可能成为新的生物标记物去诊断口腔鳞状细胞癌。第二部分LncRNA HCG11/miR-455-5P分子轴调控PTPRS对口腔鳞癌细胞株增殖的机制研究目的:体外实验通过建立多个共转染系统探讨LncRNA HCG11对OSCC细胞的调控作用,验证miR-455-5p与LncRNA HCG11和PTPRS的靶向结合关系。探讨LncRNA HCG11/miR-455-5p/PTPRS分子轴对于口腔鳞癌细胞增殖的影响以及作用机制。方法:1.qRT-PCR检测TSCCA细胞、CAL-27细胞和Fa Du细胞3种口腔鳞癌细胞株中LncRNA HCG11的表达水平。选择表达量高的两株细胞进行抑制LncRNA HCG11的表达实验,选择表达量低的细胞进行过表达LncRNA HCG11实验。2.抑制或过表达LncRNA HCG11后,通过MTT、qRT-PCR、Western Blot、流式细胞术、免疫荧光检测观察LncRNA HCG11对口腔鳞癌细胞株增殖的影响。3.在TSCCA、CAL-27两株细胞中抑制LncRNA HCG11的表达,qRT-PCR检测miR-455-5p的表达水平;RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验检测TSCCA细胞中LncRNA HCG11和miR-455-5p的富集情况;双荧光素酶实验验证两者的结合关系。4.分析LncRNA HCG11是否通过miR-455-5p影响口腔鳞癌细胞的增殖。在TSCCA和CAL-27两株细胞中,对miR-455-5p进行功能挽救实验,观察miR-455-5p抑制剂对LncRNA HCG11干扰介导的细胞增殖的逆转情况。5.分析miR-455-5p对口腔鳞癌细胞株增殖的影响及其对PTPRS的调控作用。qRT-PCR检测TSCCA、CAL-27和Fa Du 3株口腔鳞癌细胞中miR-455-5p的表达水平。在口腔鳞癌细胞株中转染miR-455-5p inhibitor或miR-455-5p mimics后,通过MTT、qRT-PCR、Western Blot技术观察miR-455-5p对口腔鳞癌细胞株增殖、PTPRS mRNA及蛋白表达水平的影响。双荧光素酶实验验证两者的靶向结合关系。6.分析miR-455-5p是否通过PTPRS下游信号通路即表皮生长因子受体/磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(EGFR/PI3K/AKT)影响口腔鳞癌细胞株的增殖。对PTPRS进行功能挽救实验,观察抑制PTPRS对miR-455-5p抑制剂介导的细胞增殖能力的逆转情况,并观察对PTPRS及下游信号通路中相关蛋白的水平变化影响。7.分析LncRNA HCG11/miR-455-5p分子轴对于PTPRS下游信号通路EGFR/PI3K/AKT的影响。在TSCCA和CAL-27两株细胞中共转染HCG11si RNA和miR-455-5p inhibitor,qRT-PCR检测转染后细胞中PTPRS mRNA的表达水平;Western Blot检测细胞中PTPRS及及下游信号通路中相关蛋白的水平变化。结果:1.LncRNA HCG11在三种细胞株中的表达水平LncRNA HCG11在TSCCA表达水平最高(1.30±0.13),其次是CAL-27细胞(1.00±0.00),在Fa Du细胞中的表达水平最低,相对表达水平为0.74±0.08。因此选择TSCCA、CAL-27两种细胞株进行抑制HCG11表达实验,选择Fa Du细胞进行过表达HCG11实验。2.LncRNA HCG11参与调控OSCC细胞株的增殖成功构建能有效抑制HCG11表达的TSCCA、CAL-27细胞株以及有效高表达HCG113000-5000的Fa Du细胞,抑制细胞株中LncRNA HCG11的表达,显著增强细胞增的殖能力;过表达LncRNA HCG11,显著降低细胞的增殖能力(P<0.05)。3.调控HCG11对于miR-455-5p表达水平的影响以及它们的靶向结合验证抑制TSCCA和CAL-27的LncRNA HCG11表达后,miR-455-5p的表达水平显著升高(P<0.01),RIP实验表明LncRNA HCG11和miR-455-5p处于高度富集状态;双荧光素酶实验表明两者存在靶向结合关系。4.LncRNA HCG11通过miR-455-5p影响OSCC的增殖miR-455-5p的表达水平受LncRNA HCG11的负向调控,miR-455-5p抑制剂可以部分逆转LncRNA HCG11抑制引起的细胞活力增强、Ki67增加、cyclin D1和E2F1水平升高、p21水平下降这些情况。5.miR-455-5p对口腔鳞癌细胞增殖的影响及其对PTPRS的调控作用研究miR-455-5p inhibitor能够明显提高Fa Du和CAL-27细胞中PTPRS mRNA及蛋白的表达水平,且显著降低细胞活力;在TSCCA细胞中转染miR-455-5p mimics可以明显降低PTPRS mRNA及蛋白的表达水平,且显著增强细胞活力。双荧光素酶实验表明两者存在靶向结合关系。6.miR-455-5p通过PTPRS下游信号通路即表皮生长因子受体/磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(EGFR/PI3K/AKT)影响OSCC细胞增殖抑制miR-455-5p的表达可以显著增加Fa Du和CAL-27细胞株PTPRS的表达水平、降低细胞增殖能力、降低p-EGFR和p-Akt表达水平,但同时抑制PTPRS后可以部分逆转miR-455-5p抑制引起的上述细胞活动。7.HCG11/miR-455-5p轴对PTPRS及其下游信号通路的调控作用LncRNA HCG11 si RNA转染后,TSCCA、CAL-27细胞株PTPRS表达水平显著降低,然而在抑制HCG11的同时抑制miR-455-5p的表达又可明显提高PTPRS的表达水平(P<0.05)。EGFR/PI3K/AKT通路相关蛋白的表达结果显示,与NC si RNA转染的细胞组相比,抑制HCG11表达组细胞中p-EGFR和p-Akt的表达水平更高,EGFR和Akt无明显变化;而同时抑制miR-455-5p和HCG11的表达水平时,p-EGFR和p-Akt的表达水平又显著降低(P<0.05)。小结:1.LncRNA HCG11参与调控OSCC细胞株的增殖,抑制LncRNA HCG11的表达显著增强细胞的增殖能力;过表达LncRNA HCG11显著降低细胞的增殖能力。2.LncRNA HCG11和miR-455-5p存在结合关系,miR-455-5p表达受LncRNA HCG11的负向调控。3.PTPRS和miR-455-5p存在靶向结合关系,PTPRS的表达受miR-455-5p的负向调控。4.PTPRS的表达受LncRNA HCG11的正向调控,LncRNA HCG11在口腔鳞状细胞癌中低表达,可作为抑癌基因,抑癌机制可能为:LncRNA HCG11吸附miR-455-5p,使下游靶基因PTPRS的表达增加,阻断下游信号通路EGFR/PI3K/AKT的激活,发挥抑癌作用。第三部分LncRNA HCG11对口腔鳞状细胞癌裸鼠移植瘤影响的研究目的:通过体内实验进一步验证LncRNA HCG11对于口腔鳞癌细胞株裸鼠荷瘤的影响。方法:1.通过脂质体2000将携带有HCG11 sh RNA或NC-sh RNA序列的p RNAH1.1载体转染到TSCCA细胞中。经过筛选获得抑制HCG11表达的稳转细胞株。2.将转染好HCG11 sh RNA(或NC sh RNA)的TSCCA细胞(1×107)注射到裸鼠右侧腋窝皮下,实验分为TSCCA组、NC sh RNA组、HCG11sh RNA 3组。当肿瘤开始形成时,每4天测量一次肿瘤大小。27天时处死小鼠,收集肿瘤并对肿瘤组织称重。3.qRT-PCR检测各组肿瘤组织中LncRNA HCG11、miR-455-5p和PTPRS mRNA的表达水平。4.Western Blot检测各组肿瘤组织中cyclin D1、E2F1、p21、PTPRS、p-EGFR、EGFR、p-AKT和AKT蛋白的表达水平。5.免疫组织化学检测各组肿瘤组织中Ki67蛋白的表达情况。结果:1.抑制HCG11表达后促进裸鼠肿瘤生长与NC sh RNA组相比,抑制HCG11表达组的裸鼠肿瘤生长更快、肿瘤重量也更大(P<0.01)。2.HCG11、PTPRS和miR-455-5p在裸鼠移植瘤中的表达情况与NC sh RNA组相比,抑制HCG11表达组中LncRNA HCG11和PTPRS的表达水平都明显降低,而miR-455-5p在抑制HCG11表达组的肿瘤组织中表现出较高的表达(P<0.01)。3.增殖相关蛋白以及信号通路相关蛋白在裸鼠移植瘤中的表达情况Western Blot结果显示,与对照组相比,抑制HCG11表达组肿瘤组织中p21明显减少,cyclin D1和E2F1表达增加。同时抑制HCG11表达组肿瘤组织中PTPRS水平降低,p-EGFR和p-Akt的表达反而增强。4.Ki67蛋白在裸鼠移植瘤中的表达情况免疫组化结果表明,在抑制HCG11表达组的肿瘤组织中Ki67阳性表达率显著增加。小结:1.成功构建能够稳定抑制LncRNA HCG11的TSCCA细胞株,并成功构建裸鼠皮下移植瘤模型。2.抑制LncRNA HCG11后可使裸鼠皮下移植瘤生长加快,重量加重。3.抑制LncRNA HCG11后,移植瘤中Ki67阳性表达显著增加,提示口腔鳞癌细胞增殖活性增强。4.抑制LncRNA HCG11后,移植瘤中HCG11和PTPRS表达水平降低,而miR-455-5p表现出较高的表达,其下游信号通路中p-EGFR和p-Akt的表达反而增强。说明LncRNA HCG11/miR-455-5p分子轴靶向调控PTPRS影响口腔鳞癌的进展。结论:1.LncRNA HCG11及PTPRS在癌组织中表达显著低于癌旁正常组织。2.LncRNA HCG11参与调控OSCC细胞株的增殖,抑制LncRNA HCG11的表达显著增强细胞的增殖能力;过表达LncRNA HCG11显著降低细胞的增殖能力。3.miR-455-5p分别与LncRNA HCG11和PTPRS存在靶向结合关系,miR-455-5p表达受LncRNA HCG11的负向调控,PTPRS的表达受miR-455-5p的负向调控。4.LncRNA HCG11在口腔鳞状细胞癌中低表达,可作为抑癌基因,抑癌机制可能为:LncRNA HCG11吸附miR-455-5p,使下游靶基因PTPRS的表达增加,阻断下游信号通路EGFR/PI3K/AKT的激活,发挥抑癌作用。5.抑制LncRNA HCG11后能显著加快人口腔鳞癌细胞株裸鼠皮下移植瘤的生长。