大脑皮质发育障碍(Malformtion of cortical development,MCD)是癫痫的主要病因之一。皮质发育障碍，如局灶性皮质发育不良（Focal Cortical Dysplasia,FCD）、结节性硬化(Tuberous Sclerosis,TSC)、半巨脑、多小脑回、无脑回畸形、及Sturge-Weber综合征等常伴有严重的癫痫发作，且皮质发育畸形越重，伴发癫痫的可能性越大。在小于3岁的儿童难治性癫痫病人中高达80%，因此MCD成为药物难治性癫痫最为重要的病因。有关MCD的致痫因素和机制的研究对难治性癫痫的防治具有重要意义。现有研究表明固有免疫炎症反应和获得性免疫炎症反应为MCDs的显著特征并且通过增加血脑屏障的通透性与神经回路的兴奋性和降低癫痫发作的阈值导致了癫痫的发生和复发[1]。促炎性因子（IL-17）在固有免疫反应和获得性免疫反应中发挥桥接作用并且IL-17及其受体的异常表达在许多中枢神经系统疾病如自身免疫性疾病，神经退行性变，缺血性脑损伤等的发生及发展过程中起重要作用。在中枢神经系统中，研究表明IL-17参与了血脑屏障的破坏，致痫因子（如：IL-1β, IL-6, TNF-α）和兴奋性神经递质的分泌以及直接作用于神经元引起神经元的兴奋性增加。由此可见，IL-17在癫痫的发生和发展中发挥了重要作用。有研究表明炎性因子（如：IL-1β, TNF-α）可激活非选择性离子通道TRPV1，激活的TRPV1可调节神经系统突触的重塑和传递以及神经元的凋亡，这些与癫痫的发生密切相关。加之，在中枢神经系统中IL-17又可诱导IL-1β, TNF-α的产生。于是我们推测IL-17可通过激活TRPV1而发挥致痫作用。据此，本课题利用MCD临床手术标本和动物模型为研究对象，研究IL-17系统在MCDs致痫灶中的表达和细胞定位；分析IL-17及其受体的蛋白表达水平与MCDs临床特征的相关性；明确激活的TRPV1在MCDs中的作用。阐明上述问题，将有助于进一步认识MCDs的致痫机制，为控制难治性癫痫发作提供实验依据和新的治疗靶点。主要实验方法：第一部分我们取正常对照皮质（CTX）和MCD（包括FCDs和TSC）临床手术标本，利用western blot测定IL-17、IL-17R及其下游信号转导分子（ACT1和NFκB-p65）蛋白水平的变化，用免疫组织化学、免疫荧光双标记测定IL-17、IL-17R及其下游信号转导分子的表达和细胞定位，研究IL-17、IL-17R及其下游信号转导分子在MCDs致痫灶中分子表型特征和分析IL-17及其受体的表达量与MCDs患者的临床特征的相关性，以初步证实IL-17系统在MCD所致难治性癫痫中的作用。第二部分我们采用IL-17与星形胶质细胞和神经元共孵育及局部皮层冰冻损伤的方法建立F-MCD小鼠模型,取sham组皮质和F-MCD模型组微脑回组织，利用western blot测定TRPV1蛋白水平的变化，用免疫组织化学、免疫荧光双标记测定TRPV1的表达和细胞定位，用在体视频脑电监测青霉素诱导WT组和TRPV1-/-组F-MCD模型小鼠行为学和脑电的变化，研究IL-17对TRPV1的作用和TRPV1在F-MCD模型小鼠微脑回中分子表型特征以及TRPV1对癫痫发作的影响，以证实IL-17通过激活TRPV1在MCD所致难治性癫痫中发挥致痫作用。主要研究结果：一、IL-17系统在FCDs致痫灶中的表达分布1.本部分研究从蛋白水平证明正常皮层内（CTX）表达IL-17、IL-17R；免疫组化结果表明IL-17及其受体IL-17R主要分布于神经元、胶质细胞和血管内皮细胞上；2.我们利用FCDs临床手术切除标本，从蛋白水平证实IL-17及其受体IL-17R在FCDIa、FCDIIa、FCDIIb皮质致痫灶中表达显著上调，并且IL-17、IL-17R的蛋白表达水平与FCDs病人手术前癫痫发作频率呈正相关。免疫组化和免疫荧光双标的研究发现，IL-17和IL-17R高表达于由神经元组成的“微柱”结构、DNs、BCs、星形胶质细胞和血管内皮细胞，同时在FCDIIa、FCDIIb皮质致痫灶中检测到了少量的IL-17阳性CD4阳性的T淋巴细胞。提示IL-17及其受体在FCDs皮质致痫灶中可能发挥致痫作用；3.我们进一步研究发现，IL-17下游的ACT1/NFκB-p65信号路径在FCDIa、FCDIIa、FCDIIb皮质致痫灶中被广泛激活。提示FCDIa、FCDIIa、FCDIIb皮质致痫灶中表达显著上调的IL-17可能通过ACT1/NFκB-p65信号路径发挥致痫作用。二、IL-17系统在TSC皮质结节中的表达分布1.在本部分研究中，我们利用TSC临床手术切除标本，从蛋白水平证实IL-17及其受体IL-17R在TSC皮质结节中表达显著上调，提示IL-17及其受体的高表达可能与TSC皮质结节的癫痫发作有关；2.免疫组化和免疫荧光双标的研究发现，IL-17和IL-17R高表达于TSC皮质结节中固有免疫细胞（DNs、GCs、星形胶质细胞、小胶质细胞），获得性免疫细胞（T淋巴细胞）以及血管内皮细胞。提示固有免疫细胞（DNs、GCs、星形胶质细胞、小胶质细胞），获得性免疫细胞（T淋巴细胞）以及血管内皮细胞为IL-17的主要细胞来源，并且IL-17可能通过破坏血脑屏障和加剧免疫炎症反应程度在TSC皮质结节中发挥致痫作用。三、IL-17激活的TRPV1在F-MCD动物模型中作用1．本部分研究我们采用星形胶质细胞和神经元共培养，经100ng/ml的IL-17孵育48h后，通过western blot检测显示：TRPV1的表达明显上调。这一结果表明IL-17可激活TRPV1并可能通过其发挥致痫作用；2．我们成功建立了小鼠F-MCD模型，其病理学改变与大鼠F-MCD模型相似，即可见微脑回形成，神经元排列紊乱，柱状极性消失，可见形态各异的异形神经元分布。这为以后的研究开辟了新的平台；3．F-MCD小鼠模型的微脑回组织匀浆中TRPV1的表达较sham组明显上调，免疫组化和免疫荧光双标结果表明TRPV1高表达于神经元（包括异形神经元）和星形胶质细胞；4．进一步采用TRPV1-/-小鼠建立F-MCD模型，经皮质内注射100单位青霉素后，通过视频脑电观察显示：TRPV1-/-组癫痫发作的Racine分级程度、持续的总时间以及放电频率/秒均显著低于WT组。提示激活的TRPV1在MCD所致难治性癫痫中发挥了重要作用，可能是抗癫痫治疗的新靶点。结论：1. IL-17在MCD所致难治性癫痫的致痫机制中发挥了重要作用，并可能通过下游的ACT1/NFκB-p65信号路径和TRPV1的激活发挥其致痫作用；2.我们成功建立了小鼠F-MCD模型，其病理学改变与大鼠F-MCD模型相似，为以后的研究开辟了新的平台。