论文部分内容阅读
[实验目的]探究调脾安肠方治疗结直肠癌肝转移（CLM）的具体作用机制,及其对肿瘤细胞上皮间充质转化（EMT）相关生物分子的调控作用。[实验方法]采用Balb-c裸鼠重建人CLM模型的方法行动物体内实验。予裸鼠行脾包膜下注射人HCT-116-LUC-tdT细胞后灌胃2周。于成模后及灌胃完成后行两次活体成像。第二次成像完成后处死裸鼠,留取循环血标本及肝脏标本。循环血标本行PCR检测miR-34a、miR-205的转录水平;肝脏标本行PCR检测上述三种miRNA及Notch1、NF-κB 的 mRNA 的转录水平,行 Western Blot 检测 Notch1、NF-κB 的蛋白表达水平,并行病理切片检查。[实验结果]（一）活体成像模型组初始相对总区域面积（T）的相对值为11.67±1.66,给药组为17.46±4.39,两组间初始T相对值无统计学差异（P=0.8312）。模型组初始相对高密度灶区域面积（A）的相对值为0.37±0.29,给药组为0.46±0.35,两组间初始A相对值无统计学差异（P=0.4960）。模型组灌胃后T的相对值为1 7.46±4.39,给药组为18.15±7.07,两组间灌胃后T相对值无统计学差异（P=0.8469）。模型组灌胃后A的相对值为2.98±0.83,给药组为0.85±0.54,两组间灌胃后A相对值有统计学差异（P=0.0010）。模型组初始A与T之比（R）的比值为3.33±2.76,给药组为3.65±2.39,两组间初始R 比值无统计学差异（P=0.8203）。模型组灌胃后R的比值为18.61±9.19,给药组为5.43±4.01,两组间灌胃后R 比值有统计学差异（P=0.0026）。模型组T灌胃前后变化量（ΔT）的相对值为5.79±4.16,给药组为6.04±7.33,两组间ΔT相对值无统计学差异（P=0.9449）。模型组A灌胃前后变化量（ΔA）的相对值为0.39±0.63,给药组为0.39±0.63,两组间ΔA相对值有统计学差异（P=0.0001）。模型组R灌胃前后变化量（ΔR）的比值为15.29±8.55,给药组为1.78±5.50,两组间ΔR 比值有统计学差异（P=0.0070）。（二）病理切片H-E染色见×100倍光镜下,对照组裸鼠肝脏病理切片中肝细胞形态规则,排列规整,未见明显异常染色;模型组裸鼠肝脏病理切片中可见较大面积嗜碱性瘤灶,其内细胞排列紊乱,与正常肝组织分界不清,仅有少部分相对正常肝组织;给药组裸鼠1肝脏病理切片中仅有散在小灶嗜碱性瘤灶,其余肝组织与对照组裸鼠肝脏切片表现一致,未见明确结缔组织瘢痕;给药组裸鼠2肝脏病理切片中也可见较大面积嗜碱性瘤灶,但瘤灶中心可见匀质嗜酸性无结构区。×400倍光镜下,对照组裸鼠肝脏病理切片中肝细胞形态规则,各细胞核着色均一,细胞质着色均一,核分裂像罕见;模型组裸鼠肝脏病理切片中嗜碱性瘤灶内细胞排列紊乱,与正常肝组织分界不清,细胞核及细胞质着色不均一,可见大量核分裂像;给药组裸鼠1肝脏病理切片中小灶嗜碱性瘤灶内细胞排列紊乱,细胞核及细胞质着色不均一,可见部分核分裂像;给药组裸鼠2肝脏病理切片中匀质嗜酸性区域周围细胞的细胞核及细胞质着色不均一,可见部分核分裂像,中央为匀质嗜酸性无细胞结构区域。（三）肝转移灶Notch1及NF-κB蛋白表达水平对照组肝转移灶Notch1蛋白的相对表达量为0.64±0.07,模型组为0.83±0.06,给药组为0.71±0.02,三组间总体Notch1蛋白相对表达量有统计学差异（P=0.0176）,组间两两比较,对照组与模型组间、模型组与给药组间Notch1蛋白相对表达量均有统计学差异（P=0.0275,0.0290）,对照组与给药组间Notch1蛋白相对表达量无统计学差异（P=0.2309）。对照组肝转移灶NF-κB-p65蛋白的相对表达量为0.48±0.02,模型组为0.63±0.09,给药组为0.54±0.06,三组间总体NF-κB-p65蛋白相对表达量无统计学差异（P=0.0602）。（四）循环血及肝转移灶EMT相关miRNA转录水平对照组循环血miR-34a-3p的相对表达量为1.92±2.04,模型组为0.60±0.08,给药组为2.96±3.24,三组间总体miR-34a-3p相对表达量无统计学差异（P=0.0589）。对照组循环血miR-34a-5p的相对表达量为0.97±0.57,模型组为2.87±1.13,给药组为3.54±1.63,三组间总体miR-34a-5p相对表达量有统计学差异（P=0.0201）,组间两两比较,对照组与模型组间、对照组与给药组间miR-34a-5p相对表达量均有统计学差异（P=0.0183,0.0107）,模型组与给药组间miR-34a-5p相对表达量无统计学差异（P=0.5606）。对照组循环血miR-205-3p的相对表达量为1.04±0.76,模型组为0.63±0.20,给药组为1.64±1.64,三组间总体miR-205-3p相对表达量无统计学差异（P=0.4133）。对照组循环血miR-205-5p的相对表达量为1.28±0.92,模型组为0.70±0.22,给药组为2.20±1.91,三组间总体miR-205-5p相对表达量有统计学差异（P=0.0209）,组间两两比较,模型组与给药组间miR-205-5p相对表达量有统计学差异（P=0.0357）,其余各组间miR-205-5p相对表达量均无统计学差异（P=0.2500,0.0952）。对照组肝转移灶miR-34a-3p的相对表达量为0.87±0.22,模型组为0.34±0.09,给药组为0.62±0.37,三组间总体miR-34a-3p相对表达量有统计学差异（P=0.0125）,组间两两比较,对照组与模型组间、模型组与给药组间miR-34a-3p相对表达量均有统计学差异（P=0.0357,0.0357）,对照组与给药组间miR-34a-3p相对表达量无统计学差异（P=0.3095）。对照组肝转移灶miR-34a-5p的相对表达量为0.80±0.24,模型组为0.06±0.00,给药组为0.39±0.40,三组间总体miR-34a-5p相对表达量有统计学差异（P=0.0172）,组间两两比较,对照组与模型组间miR-34a-5p相对表达量均有统计学差异（P=0.0020）,其余各组间miR-34a-5p相对表达量均无统计学差异（P=0.2091,0.0859）。对照组肝转移灶miR-205-3p的相对表达量为0.56±0.30,模型组为0.42±0.15,给药组为0.54±0.16,三组间总体miR-205-3p相对表达量无统计学差异（P=0.4133）。对照组肝转移灶miR-205-5p的相对表达量为0.74±0.21,模型组为0.31±0.20,给药组为0.68±0.13,三组间总体miR-205-5p相对表达量有统计学差异（P=0.0198）,组间两两比较,对照组与模型组间、模型组与给药组间miR-205-5p相对表达量均有统计学差异（P=0.0282,0.0176）,对照组与给药组间 miR-205-5p相对表达量无统计学差异（P=0.5971）。（五）肝转移灶Notch1及NF-κB基因mRNA转录水平对照组肝转移灶Notch1基因mRNA的相对表达量为0.82±0.14,模型组为1.78±0.24,给药组为1.26±0.20,三组间总体Notch1蛋白相对表达量有统计学差异（P=0.0001）,组间两两比较,对照组与模型组间、模型组与给药组间、对照组与给药组间Notch1基因mRNA相对表达量均有统计学差异（P=0.0003,0.0154,0.0041）。对照组肝转移灶NF-κB-p65基因mRNA的相对表达量为1.36±0.27,模型组为2.68±0.42,给药组为1.18±0.45,三组间总体NF-κB-p65基因mRNA相对表达量有统计学差异（P=0.0007）,组间两两比较,对照组与模型组间、模型组与给药组间NF-κB-p65基因mRNA相对表达量均有统计学差异（P=0.0014,0.0035）,对照组与给药组间NF-κB-p65基因mRNA相对表达量无统计学差异（P=0.4627）。[实验结论]调脾安肠方可通过促进EMT相关miRNA的转录,下调Notch1蛋白及其下游NF-κB蛋白的表达,从而抑制CRC细胞发生EMT过程,最终发挥抗CLM过程的临床治疗作用,即,调脾安肠方可通过EMT相关miRNA-Notch-NF-κB轴发挥抗CLM过程的作用。