【摘 要】
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鳜(Siniperca chuatsi Basilewsky)是典型的肉食性鱼类,自然条件下以活鱼虾为食,对其进行驯化后可接受人工饲料,是研究肉食性鱼类碳水化合物利用机制的优良模型。尽管鳜摄食人工饲料技术及小规模养殖试验有所研究突破,但由于鳜对人工饲料摄食和利用的个体差异大,长期养殖过程中,大部分鳜可稳定摄食人工饲料,少部分鳜会出现食欲下降现象,最终因体质变弱而死亡。鱼类对糖利用能力低,特别是肉食
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鳜(Siniperca chuatsi Basilewsky)是典型的肉食性鱼类,自然条件下以活鱼虾为食,对其进行驯化后可接受人工饲料,是研究肉食性鱼类碳水化合物利用机制的优良模型。尽管鳜摄食人工饲料技术及小规模养殖试验有所研究突破,但由于鳜对人工饲料摄食和利用的个体差异大,长期养殖过程中,大部分鳜可稳定摄食人工饲料,少部分鳜会出现食欲下降现象,最终因体质变弱而死亡。鱼类对糖利用能力低,特别是肉食性鱼类日粮中糖类物质大约占20%,但鳜是天生糖不耐受。因此,本研究以鳜为研究对象,将摄食8%高糖饲料一定周期后出现厌食的鳜与长期稳定摄食饲料的鳜进行高通量测序,从RNA水平分析差异表达基因,进而分析鱼体糖脂代谢及蛋白质代谢的变化,最后探究摄食变化是否与表观遗传学有关。实验一,使用Illumina Hi Seq平台一共测得60.46 Gb数据。组装并去冗余得到142,098个unigene,对其进行差异基因分析共得到31,369个上调基因和5,871个下调基因。同时,对差异表达基因进行KEGG生物通路分类及富集分析发现,其中有代表性的通路是m TOR(m TOR signaling)、脂肪细胞因子(adipocytokine)、神经活性配体-受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、AMPK信号(AMP-activated protein kinase)、5-羟色胺能突触(serotonergic synapse signaling)、胰岛素信号(insulin signaling)和胆汁分泌(bile secretion)。代表性差异表达基因分为三类:(1)糖代谢相关差异基因:葡萄糖转运蛋白1(glut1),葡萄糖转运蛋白4(glut4),磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pepck)和果糖-1,6-二磷酸酶(fbp)等;(2)细胞增殖和分化相关差异基因:丝裂原活化蛋白激酶1/3(erk),胰岛素受体(insr),磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶(pi3k),囊泡胺转运蛋白1/2(vmat),核糖体蛋白S6(s6),细胞信号抑制因子3(socs3)和生长因子受体结合蛋白2(grb2)等;(3)食欲调控相关差异基因:可卡因苯丙胺调节转录物(cart),神经肽Y受体1(npy1r),雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mtor),瘦素受体(lepr),5-羟色胺受体3(5-htr3),胰岛素受体底物1(irs1)等。故而推测,鳜厌食的主要原因是机体响应摄食中枢调控(m TOR-CART),调控m TOR表达进而调控CART基因表达,抑制摄食,并且厌食组鳜感知糖代谢、细胞增殖和分化及其他食欲调控相关基因表达水平变化,通过下丘脑整合信号,抑制鳜摄食。实验二,经过食性驯化且摄食高糖饲料一段时间的鳜,检测稳定摄食人工饲料组鳜和厌食组鳜血糖、肝糖原、肌糖元、血胰岛素、血甘油三酯的含量变化以及核糖体蛋白S6磷酸化水平。结果显示,(1)厌食组鳜血糖含量显著高于稳定摄食人工饲料组鳜(P<0.05);(2)厌食组鳜肝糖原和血甘油三酯含量显著低于稳定摄食人工饲料组鳜(P<0.05);(3)厌食组肌糖元血胰岛素含量与稳定摄食人工饲料组鳜无显著差异(P>0.05);(4)厌食组鳜核糖体蛋白S6磷酸化水平显著高于稳定摄食人工饲料组鳜(P<0.05)。综上所述,核糖体蛋白S6磷酸化水平上调,进一步说明摄食中枢(m TOR-S6-CART)上调m TOR下游因子核糖体蛋白S6,进而调控CART基因表达,抑制摄食。此外,厌食组鳜摄入体内的糖,并没有转化为糖原和脂肪,而是维持高血糖,表明厌食组鳜无法很好的利用糖,而持续高血糖会调控食欲信号通路,抑制摄食。实验三,本研究通过对鳜pepck和glut1基因启动子区域前3000 bp进行预测得到的Cp G位点进行甲基化分析。选用本试验中的鳜肝脏样品(n=6),提取组织总DNA,重亚硫酸盐测序法用于DNA甲基化检测分析。结果表明,(1)厌食组鳜pepck基因DNA甲基化水平及基因表达水平均显著高于稳定摄食人工饲料组鳜(P<0.05);(2)厌食组鳜glut1基因DNA甲基化水平显著低于稳定摄食人工饲料组鳜,但glut1基因表达水平显著高于稳定摄食人工饲料组鳜(P<0.05)。综上所述,即糖异生相关基因pepck的甲基化程度越高,促进pepck基因m RNA表达,血糖水平升高,不仅抑制鳜摄食,还促进机体glut1基因m RNA表达,且此时厌食组鳜glut1处于低甲基化状态进一步加强glut1基因表达。本研究从转录组学及表观遗传学的角度阐述高糖饲料抑制鳜摄食调控及造成鱼体糖脂代谢紊乱的机制,为鱼类摄食调控及糖脂代谢研究提供理论依据,也为水产动物饲料研发和改良提供可行性方向。
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