论文部分内容阅读
欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok],属蔷薇科樱桃属,是一种果实富含类胡萝卜素的小灌木果树。类胡萝卜素作为一种天然色素,在药品、化妆品和食品添加等生产工艺方面有重要作用。通过生物工程手段调控类胡萝卜素的合成有助于功能性产品研发和推广,可提升食品安全管理效果,维护人类身体健康。类胡萝卜素在类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD）催化下生成多种脱辅基类胡萝卜素,对植物香气、色泽、独角金内酯的形成及胁迫响应起着重要作用。本研究通过生物信息学的方法对欧李CCD基因家族（Ch CCD）进行鉴定与分析,并利用q RT-PCR分析Ch CCDs基因在‘农大4号’果实不同生长发育时期的表达模式。此外,以欧李‘农大4号’为材料,克隆Ch CCD7、Ch NCED1和Ch NCED5基因,构建Ch CCD7和Ch NCED1的原核表达载体,并诱导基因在大肠杆菌体系中表达,对后续类胡萝卜素工程菌功能分析及裂解产物脱辅基类胡萝卜素的应用有一定参考价值,为欧李育种工作奠定基础。主要研究结果如下:1.根据欧李基因组数据共鉴定出10个CCD基因,包括Ch CCD-like-a、Ch CCD-like-b、Ch CCD1a、Ch CCD1b、Ch CCD4、Ch CCD7、Ch CCD8、Ch NCED1、Ch NCED5和Ch NCED6。Ch CCD家族成员之间的蛋白质大小、等电点等特征参数差异不大,均属于亲水性蛋白。氨基酸序列比对显示,大多数Ch CCD蛋白包含保守的四个组氨酸活性位点,而Ch CCD-like-a和Ch CCD-like-b缺失第一个组氨酸活性位点,这可能是两个基因与其他基因的差别所在。系统进化分析显示,10个CCD家族成员分为CCD1、CCD4、CCD7、CCD8、NCED和CCD-like六个亚家族,欧李CCD蛋白与桃和梅的亲缘关系更近,与苹果和梨的亲缘关系较远。基因结构发现各亚族基因结构相似,其中NCED亚族只有一个外显子,不含内含子。启动子顺式元件分析结果显示,Ch NCED5和Ch NCED6基因与脱落酸调控存在密切关系。2.转录组分析得出:在欧李‘农大3号’、‘农大4号’和‘农大5号’果实不同生长发育过程中,10个基因表达趋势不完全一致,可分为四类,如Ch CCD-like-a、Ch CCD-like-b、Ch CCD7、Ch CCD8和Ch NCED6均未表达,Ch NCED1和Ch NCED5整体呈上升趋势,Ch CCD1a和Ch CCD1b无明显差异,Ch CCD4表达量较低且整体呈下降趋势。在‘农大4号’和‘农大5号’果实成熟期,10个基因表达趋势基本一致,Ch CCD-like-a、Ch CCD-like-b、Ch CCD7、Ch CCD8和Ch NCED6均未表达,Ch CCD4表达量较低,Ch NCED5表达量最高,Ch NCED1在‘农大4号’果实成熟期表达量高于‘农大5号’。在欧李‘农大4号’不同组织中的表达模式有五种,在果实中Ch NCED5高水平表达,在叶片中Ch CCD1a、Ch CCD1b和Ch CCD4优势表达,在种仁中Ch CCD1a和Ch CCD1b表达量高,在根状茎和真根中Ch CCD1a表达量最高。由上述推测,Ch NCED1和Ch NCED5基因可能与果实成熟存在密切关系。3.利用q RT-PCR技术对10个CCD基因在‘农大4号’欧李果实不同生长发育时期的表达模式进行分析,大致可分为3种类型:如Ch CCD-like-a、Ch CCD-like-b、Ch NCED1和Ch NCED6呈升-降-升-降的趋势;Ch CCD1a、Ch CCD1b、Ch CCD4、Ch CCD7和Ch CCD8呈降-升-降的趋势;Ch NCED5呈上升趋势,且与先前转录组数据分析的表达模式一致。故推测Ch NCED5基因可能与果实生长发育存在一定的关系。4.根据全基因组测序获得的数据库,结合同源序列法分析得到Ch CCD7、Ch NCED1和Ch NCED5基因的CDS序列并设计引物,以‘农大4号’欧李嫩茎c DNA为模板,扩增出连有酶切位点的Ch CCD7基因的CDS序列;以‘农大4号’欧李成熟期果实c DNA为模板,扩增出连有酶切位点的Ch NCED1和Ch NCED5基因的CDS序列。对Ch CCD7、Ch NCED1和Ch NCED5蛋白的生物信息学分析结果表明,欧李Ch CCD7编码615个氨基酸,相对分子质量约为68499.76Da,理论等电点为5.67,脂溶指数为83.51;欧李Ch NCED1编码632个氨基酸,相对分子质量约为70288.74Da,理论等电点为6.73,脂溶指数为73.61;欧李Ch NCED5编码617个氨基酸,相对分子质量约为68027.19Da,理论等电点为6.45,脂溶指数为79.00;Ch CCD7、Ch NCED1和Ch NCED5均为没有信号肽的亲水性蛋白,蛋白二级结构中延伸链和无规则卷曲所占比例较高,具有CCD家族典型结构域。5.成功构建了原核表达载体p ET-Ch CCD7和p ET-Ch NCED1,在37℃条件下经IPTG诱导后两个基因均能表达目的蛋白,且目的蛋白大小约为69和70KDa,均与预测蛋白大小相符。