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第一部分:小续命汤干预脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用与代谢组学研究。目的:探讨小续命汤（Xiao-Xu-Ming Decoction,XXMD）对脑缺血再灌注（Cerebral Ischemia/Reperfusion,CIR）大鼠神经功能缺损、脑梗死面积以及神经元损伤影响。基于代谢组学技术研究脑缺血再灌注及小续命汤干预后大鼠皮层脑区代谢变化。方法:本实验采用250-280g SPF级健康成年Sprague-Dawley（SD）大鼠,随机分成3组:假手术+生理盐水组（Sham）;脑缺血再灌注模型+生理盐水组（MCAO）;脑缺血再灌注模型+小续命汤组（XXMD）。MCAO和XXMD组采用大脑中动脉栓塞法进行脑缺血再灌注模型制造,假手术组只分离血管而不插入线栓。XXMD组在造模前7天开始灌胃小续命汤30mL/kg/day（药物浓度2g/ml）,Sham组与MCAO组在相同时间点灌胃相应体积的生理盐水,每日两次。采用改良神经缺损评分（Modified Neurological Severity Scores,mNSS）对各组大鼠神经功能进行评估;采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyte-trazoliumchloride,TTC）染色法测量各组大鼠脑梗死面积;采用HE染色、Nissl染色、NeuN免疫荧光染色对各组大鼠脑组织切片进行病理学染色,评估皮层和海马细胞损伤严重程度。收集缺血再灌注24小时各组大鼠脑区样本,使用600MHz超导高分辨核磁共振谱仪对各组皮层样本进行核磁共振检测。采用多元分析方法分析各组实验大鼠的代谢差异,寻找差异代谢物并进行定量。结果:mNSS评分结果显示,MCAO组大鼠神经功能明显受损,而小续命汤处理后其神经功能得到一定程度恢复。TTC染色结果显示,缺血再灌注24小时后大鼠出现了明显的梗死区域,而XXMD组梗死面积少于MCAO组且有统计学意义。HE染色显示相比较于假手术组,MCAO组皮层和海马区域细胞排列紊乱,细胞形态肿胀并出现核固缩,提示脑组织结构及细胞形态受到破坏。小续命汤干预治疗后,改善上述变化。通过尼氏染色和NeuN免疫荧光染色发现,脑缺血再灌注导致皮层和海马区域的神经元受损严重,小续命汤给药后,神经元损伤得到一定程度改善。对各组大鼠皮层代谢组学分析,PLS-DA结果显示缺血再灌注24小时,三组大鼠皮层代谢出现差异。OPLS-DA分析结果显示,MCAO组与Sham和XXMD组两组之间均存在代谢差异,并通过VIP图得到差异代谢物;经过相对定量得出,小续命汤可以明显改善显著下降的肌酸、肌醇、牛磺酸、天冬氨酸、谷氨酰胺代谢水平,降低明显升高的葡萄糖、缬氨酸、异亮氨酸、琥珀酸、γ-氨基丁酸、胆碱和磷酸胆碱代谢水平。乳酸含量在MCAO组中明显增加,但小续命汤干预后,乳酸代谢水平只有下降趋势,而无显著性差异。结论:小续命汤能通过改善缺血再灌注引起的神经功能缺损、减少梗死面积,减缓梗死区域皮层和海马神经元细胞损伤发挥神经保护作用。同时小续命汤能够改变缺血再灌注24小时大鼠皮层代谢模式,改善能量、磷脂和氨基酸等代谢。第二部分:小续命汤通过调控脑缺血再灌注大鼠乳酸穿梭和激活AMPK/SI RT1/FoxO1A信号通路抗氧化应激和凋亡。目的:探讨小续命汤能否促进星形胶质-神经元乳酸穿梭改善能量代谢和激活AMPK/SIRT1/FoxO1A信号通路,抑制氧化应激和凋亡从而发挥神经保护作用。方法:选取250-280g SPF级SD大鼠进行随机分组,造模及给药方法与前文一致。缺血再灌注24小时后收集各组大鼠脑区,使用试剂盒分别测定各组大鼠脑组织中ATP、NA D+/NADH、葡萄糖和乳酸含量,通过实时定量PCR法测定三羧酸循环、糖酵解相关蛋白酶mRNA表达检测小续命汤对缺血再灌注大鼠能量代谢的影响。通过蛋白免疫印迹法和免疫荧光染色法测定星形胶质-神经元细胞乳酸穿梭相关蛋白的表达水平,观察小续命汤对乳酸穿梭机制的作用。AMPK/SIRT1/FoxO1A通路蛋白和基因表达分别由免疫蛋白印迹和实时定量PCR进行测定,验证小续命汤对通路的激活作用。最后测定三组大鼠脑组织中丙二醛、过氧化氢酶、谷胱甘肽含量,使用TUNEL染色观察大鼠细胞凋亡水平,并测定氧化应激和凋亡相关蛋白的基因和蛋白表达情况。结果:MCAO组大鼠脑组织中ATP含量、NAD+/NADH 比值明显降低,葡萄糖和乳酸含量升高。小续命汤干预后ATP、NAD+/NADH的异常下降得到逆转,葡萄糖含量显著降低,乳酸水平没有差异性变化。免疫荧光共定位实验证实MCT2主要表达在神经元上。WB结果显示乳酸穿梭相关蛋白MCT1、MCT4在小续命汤干预后显著升高,MCT 2、LDHB在缺血再灌注后蛋白表达下降,小续命汤给药后回升。蛋白印迹实验和PCR结果证实小续命汤可以激活AMPK/SIRT1/Fox1A信号通路,促进AMPK磷酸化、SIRT 1表达升高和FoxO1A的去乙酰化。同时小续命汤抑制缺血再灌注引起的氧化应激和凋亡。降低脑组织中MDA的含量,提高GSH、CAT的活性,提高抗氧化应激基因和蛋白的表达水平,抑制促氧化应激基因和蛋白表达。TUNEL染色结果显示,MCAO组中出现大量阳性点,提示缺血再灌注引起细胞凋亡。给予小续命汤处理后,TUNEL阳性点显著减少,同时伴随着Bc12的升高和Bax、Cleaved-Caspase3/Caspase3下降。结论:小续命汤通过促进星形胶质-神经元细胞乳酸穿梭,增加神经元细胞对乳酸的利用从而改善能量代谢。同时,小续命汤激活AMPK/SIRT1/FoxO1A信号通路抑制缺血再灌注引起的氧化应激和凋亡从而发挥神经保护作用。