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肺癌为全球癌症相关死亡的首要原因,位居男性及女性癌症相关死亡率首位,为最常见的恶性肿瘤之一。据统计,2018年美国预计新增肺癌患者23万例,其中预计15万例患者将死于肺癌[1]。截止目前,我国的肺癌主要治疗方式有放化疗、药物靶向治疗、手术治疗,但中晚期肺癌患者治疗效果不太理想,大部分中晚期患者5年生存率不足15%[2]。国际肺癌筛查项目统计可知,Ⅰ期肺癌患者手术后10生存率可高达88%,可见肺癌的准确诊断是降低肺癌患者死亡率的关键措施[3]。由于肺癌患者早期无明显特异性的症状,大部分患者确诊时均为中晚期,或已出现淋巴转移及发生局部侵袭。而目前肺癌的筛查手段有痰细胞学、胸部X线、肺部低剂量螺旋CT,其检查结果特异性差,灵敏度低,无法准确筛查肺癌。因此,发现一种肺癌诊断分子标记物为亟待解决的问题,而研究肺癌诊断的血清lncRNA分子标记物有助于肺癌的筛查及诊断。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)为不参与蛋白质编码且无开放性阅读窗的长度大于200nt的非编码RNA,在转录、转录后及翻译等多个层面发挥着重要作用,作为“分子诱饵”诱导特定蛋白结合[4-6]。近几年lncRNA的机制研究成为热点,已有部分研究表明lncRNA参与多种肿瘤的增殖、转移、凋亡及侵袭。有研究表明,lncRNA不仅存在肿瘤患者组织中,同时存在于外周血中,但目前lncRNA作为肺癌患者血清标记物的研究较少。目的:1、筛选人血清RNA提取的最佳方法。2、在6种候选内参基因中筛选出人血清RNA中稳定表达的最适内参引物。3、在数据库中挑选5种候选lncRNA基因,检测5种候选基因在肺癌患者血清中差异性表达情况,筛选出明显差异表达的基因,并分析临床诊断价值。 方法:1.本研究从内蒙古医科大学附属医院收集60例病理组织活检确诊的肺癌患者血清标本(其中20例肺腺癌,20例鳞癌,20例小细胞肺癌)和20例正常人血清标本,同时统计患者信息及详细临床资料。2.采用改良手工法、QIAGEN试剂盒法、TIANGEN试剂盒法提取血清中总RNA,Nano Drop2000检测以上3种方法提出总RNA的浓度及纯度。3.选择10例肺癌患者血清提取总RNA,通过实时荧光定量PCR法检测6个候选内参在肺癌患者血清中表达情况,采用geNorm、Norm Finder软件分析qPCR数据,评价6个候选内参基因在肺癌患者血清中的稳定性,筛选血清中稳定表达的最适内参基因。4.在NCBI、“The LncRNA and Disease Datebase”数据库和文献中挑选5个lncRNA候选基因,并在符合条件的60例肺癌患者血清(其中20例肺腺癌,20例鳞癌,20例小细胞肺癌)和20例正常人血清中,通过实时荧光定量PCR法检测5种lncRNA候选基因表达情况。5.统计分析数据采用SPSS22.0软件进行统计分析,当P<0.05时认为差异具有统计学意义,并采用受试者工作曲线(ROC曲线)对血清lncRNA差异性表达的临床诊断价值进行分析。 结果:1.改良手工法提取的RNA纯度及浓度均高于QIAGEN试剂盒法及TIANGEN试剂盒法,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.通过geNorm,Norm Finder计算6个候选内参基因表达稳定值M,表达稳定性由弱至强排序依次为GAPDH<GUSB<CYC<HPRT1<18SrRNA和β-actin。3.肺腺癌患者血清中ANRIL呈高表达(P<0.01),平均表达倍数为8.415±0.1550;肺鳞状细胞癌血清中XIST呈高表达水平(P<0.05),平均表达倍数为4.044±0.1569;肺小细胞癌患者血清中,ANRIL,SPRY4-IT1,XIST均高表达(P<0.05),其平均表达倍数分别为1.571±0.09571,2.787±0.1371,1.437±0.09293。4.在对肺腺癌,鳞癌,小细胞癌血清lncRNA的联合筛查中,lncRNA ANRIL的AUC为0.966,灵敏度为83.3%,特异性为100%(P<0.01),具有较高临床诊断价值;XIST的AUC为0.818,灵敏度为81.8%,特异性为95.2%(P<0.01),具有中等临床诊断价值。 结论:1.改良手工法提取血清总RNA的纯度和浓度优于试剂盒法。2.肺癌患者血清实时荧光定量PCR最适内参引物为β-actin。3.ANRIL在腺癌和小细胞癌症呈高表达,而在鳞癌中呈低表达水平;SPRY4-IT1在小细胞癌中的表达水平高于腺癌和鳞癌;XIST在鳞癌和小细胞癌表达水平较高,而在腺癌中表达呈下调趋势。根据5种lncRNA候选基因ANRIL,H19,HIF1A-AS1,SPRY4-IT1和XIST分别在肺腺癌,鳞癌和小细胞肺癌中的表达情况,筛选出3种差异表达的特异性lncRNA,即XIST,ANRIL,SPRY4-IT1。4.LncRNA ANRIL在肺腺癌、鳞癌,小细胞癌联合筛查中,具有较高的临床诊断价值;XIST在肺腺癌、鳞癌,小细胞癌联合筛查中,诊断价值中等。因此,可采取ANRIL和XIST联合作为肺癌分子诊断标记物。