血吸虫病（Schistosomiasis）是一种重要的人兽共患病,其广泛流行于中东、南美、东南亚,特别是撒哈拉以南的非洲地区。血吸虫病主要由日本血吸虫（Schistosoma japonicum）、曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）、埃及血吸虫（Schistosoma haematobium）引起的,在中国主要流行的是日本血吸虫病。对人类来讲,血吸虫病危害生命健康并造成了严重的社会经济负担。由于缺乏有效疫苗,血吸虫病的治疗主要依赖于吡喹酮（Praziquantel,PZQ）,但PZQ对童虫治疗效果较差,不能预防再感染,并且对混合感染疗效不佳。另外,长期、大量、反复依赖单一的PZQ用药使得血吸虫产生耐药性的威胁日益严峻,且在临床和实验室中都已有耐药性的证据出现。所以,研发候选抗血吸虫新药具有十分重要的意义。本课题组在前期研究中,通过偶联PZQ及青蒿琥酯药效基团构建了新型PZQ衍生物DW-3-15（专利号:ZL201110142538.2）,并通过体内外实验证明,DW-3-15具有良好的抗童虫及成虫效果,显示出潜在的应用前景,特别是经TMT（Tandem mass tags labeling proteome quantification）测定分析表明,DW-3-15 作用前后成虫的差异蛋白组分显示,其杀虫机制可能与抑制虫体组蛋白乙酰转移酶（SjHAT1）有关,且其作用靶点可能与PZQ存在差异,后续研究也发现DW-3-15在体内外均可影响日本血吸虫成虫和童虫的SjHAT1转录和表达水平。本研究将在前期研究基础上继续探究DW-3-15在体外抗日本血吸虫生物学效应及机制,运用HAT抑制剂与RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术进一步证明SjHAT1是DW-3-15抗血吸虫的潜在药物靶点,也为SjHAT1可作为潜在药物靶点,探索研发新的抗血吸虫药物,提供科学依据。一、吡喹酮衍生物DW-3-15体外抗日本血吸虫生物学效应目的:探究DW-3-15体外对日本血吸虫活力、形态学、体表超微结构和SjHAT1转录水平的影响。方法:日本血吸虫尾蚴经皮肤感染小鼠,采用肝门静脉灌注法,于感染后的14 d及35 d分别收集童虫和成虫。虫体置于DMEM培养基中,加入终浓度为100μM的DW-3-15或PZQ培养72 h,期间每24 h观察并统计虫体活力和虫体存活率。培养结束后,采集虫体图像,收集虫体,使用扫描电镜观察虫体体表超微结构。提取虫体RNA,用实时荧光定量PCR检测各组虫体SjHAT1的转录水平。结果:1.虫体体外培养活力观察显示:经100 μM PZQ及DW-3-15作用24 h、48 h及72 h后,不管是雌虫、雄虫还是童虫均出现致死效应,活力也均显著性下降（P＜0.0001）。PZQ处理组成虫在作用72 h后,存活率为15%,活力降低率达到了 95%（P＜0.0001）。DW-3-15处理后的成虫则在作用48 h后就全部死亡。经DW-3-15作用24 h后,雌虫的活力降低率也达到了 91.7%（P＜0.0001）,而PZQ处理组为73.3%（P＜0.0001）;雄虫的活力降低率达到了 95%（P＜0.0001）,而PZQ处理组为85%（P＜0.0001）。相比之下,PZQ对童虫的杀伤效果较弱。PZQ作用童虫24 h、48 h及72 h后,存活率分别为75%、65%和60%,活力降低率分别为 60%（P＜0.0001）、66.7%（P＜0.0001）和 73.3%（P＜0.0001）,随着PZQ作用时间的增长,童虫的活力降低率增加并不明显,而DW-3-15对童虫的杀伤效果非常显著,经DW-3-15作用童虫24 h、48 h及72 h后,活力降低率分别为 83.3%（P＜0.0001）、93.3%（P＜0.0001）和 100%（P＜0.0001）。2.形态观察显示:当100 μM DW-3-15作用日本血吸虫72h后,雌虫发生团状卷曲,雄虫出现肿胀、发白和皱缩,童虫呈短棒状结构;当100μM PZQ作用日本血吸虫72h后,雌虫发生杂乱的S型卷曲缠绕,雄虫出现轻度的麻痹性蜷缩,童虫呈U型蜷缩,头尾具有一定运动性。3.电镜结果显示:DW-3-15处理组雌虫体表受损严重,可见明显脱落的皮层,虫体头端的口吸盘与腹吸盘结构紊乱,虫体中段肌层出现裂口,腹吸盘内部的棘状结构出现融合,体表肿胀使得横脊状结构变得稀疏;DW-3-15处理组雄虫整体肿胀非常明显,抱雌沟外侧表皮损伤严重,抱雌沟内侧肿胀导致闭合,腹吸盘内部的棘状结构溶解,球状感受器和回型嵴消失,暴露出肌层并伴有裂缝。4.实时荧光定量PCR结果显示:经100 μM DW-3-15或PZQ作用72 h后,雌虫与雄虫SjHAT1转录水平较对照组均呈显著下调趋势,但DW-3-15作用后的雌虫和雄虫的SjHAT1转录水平下调更为显著（P＜0.001;P＜0.01）。经100 μM DW-3-15作用72 h后,童虫SjHAT1转录水平出现轻微下调,无显著性差异。而经100 μM PZQ处理72 h后,童虫的SjHAT1转录水平呈显著性上调（P＜0.001）。结论:在体外实验中,DW-3-15有着优于PZQ的抗日本血吸虫效应,特别是在抗童虫方面。此外,DW-3-15作用后,日本血吸虫成虫SjHAT1转录水平呈显著下调趋势,提示SjHAT1可能是DW-3-15潜在作用靶点。二、HAT抑制剂体外抗日本血吸虫生物学效应目的:利用HAT抑制剂体外作用于日本血吸虫,观察其抗虫效应拟证明SjHAT1是否为DW-3-15的潜在作用靶点,也为SjHAT1可能作为新的药物靶点研究,提供实验证据。方法:日本血吸虫尾蚴经皮肤感染小鼠,采用肝门静脉灌注法,于感染后的14 d及35 d分别收集童虫和成虫。虫体置于DMEM培养基中,分别加入三种HAT 抑制剂,终浓度分别为 10 μM～50μM A485、10 μM～50 μM C646 和 20 μM～100 μM Curcumin（姜黄素）培养72 h,期间每24 h观察并统计虫体活力和虫体存活率。培养结束后,采集虫体图像,收集虫体,使用扫描电镜观察虫体体表超微结构。提取虫体RNA,用实时荧光定量PCR检测各组虫体SjHAT1的转录水平。结果:1.虫体体外培养活力观察显示:三种HAT抑制剂中,姜黄素对日本血吸虫的杀伤效果最为显著,且具有剂量依赖性。A485和C646体外作用日本血吸虫后,均没有出现致死现象。不同浓度A485作用72 h后,雌虫、雄虫和童虫的最高活力降低率分别为6.7%、10%和13.3%,不同浓度C646作用72 h后,雌虫、雄虫和童虫的最高活力降低率分别为15%（P＜0.01）、13.3%和28.3%（P＜0.0001）。经不同浓度姜黄素作用24 h后,60μM～100μM浓度组均出现了死亡虫体,其中100 μM浓度组的雌虫活力降低率达到了 100%（P＜0.0001）。作用到48 h后,80 μM～100 μM浓度组的所有虫体均全部死亡。作用到72 h后,40 μM～100μM浓度组的雌虫全部死亡,60 μM～100μM浓度组的雄虫和童虫全部死亡。2.形态观察显示:经A485作用72 h后,日本血吸虫成虫形态变化不明显,与正常虫体无差异,50 μM浓度组的个别童虫出现了肿胀;经C646作用72 h后,个别雌虫发生了卷曲,雄虫与对照组相比无差异,部分童虫出现肿胀;经姜黄素作用72 h后,40μM～100 μM浓度组的雌虫全部呈团状卷曲状态,60 μM～100μM浓度组的雄虫均出现明显肿胀,并且虫体轻度弯曲,60 μM～100 μM浓度组的童虫明显肿胀变粗,伸缩性下降,体型变短。3.电镜结果显示:姜黄素处理组雌虫前端口腹吸盘受损严重,口腹吸盘边缘界线模糊,虫体表皮出现大面积脱落,腹吸盘内部棘状结构排列紊乱,相互融合,横脊状结构明显肿胀间隔变宽,且相互融合,暴露皮下肌层组织;姜黄素处理组雄虫抱雌沟损伤严重,有明显肿胀,伴有坑洞样损伤,腹吸盘内部棘状结构紊乱,出现溶解,球状感受器和回型嵴消失,肌层损伤严重,坑洼不平。4.实时荧光定量PCR结果显示:经A485和C646作用72 h后,日本血吸虫雌虫和雄虫SjHAT1转录水平较正常对照组均呈上调趋势。10 μM A485和C646浓度组的童虫SjHAT1转录水平均显著低于正常对照组（P＜0.05;P＜0.05）,随着抑制剂A484和C646浓度的升高,SjHAT1转录水平升高,但与正常对照组相比无显著差异。不同浓度姜黄素作用72 h后,雌虫SjHAT1转录水平随姜黄素浓度的升高而降低,姜黄素浓度为100μM时,雌虫SjHAT1的转录水平降至最低（P＜0.01）。20μM和40 μM浓度组的雄虫SjHAT1转录水平显著高于对照组（P＜0.01;P＜0.01）,当姜黄素浓度升至60 μM以后,雄虫SjHAT1转录水平随浓度增加而降低,至浓度为100μM时,显著低于正常对照组雄虫（P＜0.05）。20μM和40 μM浓度组的童虫SjHAT1转录水平高于对照组,随姜黄素浓度的增高,童虫SjHAT1的转录水平逐渐下降,在姜黄素浓度为80 μM和100μM时,童虫SjHAT1的转录水平显著低于对照组（P＜0.05;P＜0.05）。结论:三种HAT抑制剂中姜黄素在体外对日本血吸虫杀伤效果最为显著,效果与同浓度DW-3-15相似,且有剂量依赖性,并且虫体出现了与DW-3-15作用后相似的形态学变化和体表超微结构特征。同时,高浓度组的姜黄素有效抑制了日本血吸虫SjHAT1转录水平,提示DW-3-15的抗血吸虫效应可能通过抑制SjHAT1发挥作用。三、SjHAT1-dsRNA RNAi抗日本血吸虫生物学效应目的:通过合成靶向SjHAT1的dsRNA进行RNAi,从而敲低日本血吸虫SjHAT1 mRNA水平,进而观察RNAi后虫体的表型与DW-3-15作用后表型是否相似,并为SjHAT1可能作为新的药物靶点研究,提供实验证据。方法:1.通过体外转录合成靶向SjHAT1的SjHAT1-dsRNA。2.日本血吸虫尾蚴经皮肤感染小鼠,采用肝门静脉灌注法,于感染后的14 d及35 d分别收集童虫和成虫。虫体置于DMEM培养基中,加入终浓度为5μg/mL～40 μg/mL SjHAT1-dsRNA培养72 h,期间每24 h观察并统计虫体活力和虫体存活率。培养结束后,采集虫体图像,收集虫体,使用扫描电镜观察虫体体表超微结构。提取虫体RNA,用实时荧光定量PCR检测各组虫体SjHAT1的转录水平。结果:1.虫体体外培养活力观察显示:5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL和40 μg/mL的SjHAT1-dsRNA作用24 h后,日本血吸虫雄虫、雌虫和童虫均100%存活,虫体活力仅有轻度降低,随着作用时间延长,虫体活力降低率增高,作用72 h后,雌虫和童虫均100%存活,雄虫个别虫体出现死亡,20 μg/mL组别雄虫存活率为85.7%,不同浓度组雄虫的活力降低率分别为26.2%（P＜0.05）、26.2%（P＜0.05）、33.3%（P＜0.01）和 29.8%（P＜0.01）,雌虫的活力降低率分别为 16.7%、19.0%（P＜0.05）、15.5%和 20.2%（P＜0.05）,童虫的活力降低率分别为 9.5%、16.7%、11.9%和 23.8%（P＜0.01）。2.形态观察显示:经不同浓度SjHAT1-dsRNA作用72h后,雌虫均出现了消化道部位肿胀,其中5 μg/mL组尤为明显,但没有出现明显的卷曲;雄虫经RNAi后虫体出现了轻微肿胀,20 μg/mL和40 μg/mL浓度下虫体肿胀较为明显。童虫整体依然保持着透明的状态,但是伸缩性下降,且体态僵硬,虫体皱缩。3.电镜显示:RNAi处理组雌虫头部发生轻度肿胀,表皮出现大量水泡,虫体中段表皮出现大面积脱落,腹吸盘内部棘状结构发生部分融合,横脊状结构无明显变化:RNAi处理组雄虫整体发生明显肿胀,抱雌沟肿胀轻微闭合,边缘受损严重,体表球状感受器分布不均匀,腹吸盘内部棘状结构尖端变钝,底部出现溶解,回型嵴也出现轻度肿胀,不再陡峭。4.实时荧光定量PCR显示:经不同浓度SjHAT1-dsRNA作用24 h后,所有浓度组雌虫、雄虫和童虫的SjHAT1转录水平均显著下降（P＜0.0001）。当作用时间延长到72 h,不同浓度下的雌虫、雄虫和童虫SjHAT1转录水平均出现回调,但大部分组别虫体SjHAT1转录水平仍显著低于正常对照组。结论:本研究通过合成靶向SjHAT1的dsRNA进行RNAi,有效的敲低了日本血吸虫SjHAT1 mRNA水平,并且与DW-3-15作用后部分表型相似,但表型变化较DW-3-15组程度较弱。与HAT抑制剂姜黄素相比,SjHAT1-dsRNA更具有靶向性。实验结果进一步证明了 SjHAT1可能是DW-3-15的作用靶点,同时也为SjHAT1可能作为抗血吸虫的潜在药物靶点,提供新的实验依据。四、DW-3-15体外对日本血吸虫组蛋白乙酰化及表达水平的影响目的:基于前文实验结果,进一步研究DW-3-15对日本血吸虫SjHAT1的表达水平、组蛋白乙酰化水平及组蛋白表达水平的影响,为阐明DW-3-15抗虫作用机制,提供科学依据。方法:日本血吸虫尾蚴经皮肤感染小鼠,采用肝门静脉灌注法,于感染后的14 d及35 d分别收集童虫和成虫。虫体置于DMEM培养基中,分别加入终浓度为 100μM的 DW-3-15、PZQ、姜黄素和 5 μg/mL～40 μg/mL 的 SjHAT1-dsRNA培养72 h,培养结束后收集虫体,提取虫体总蛋白,Western blotting检测各组虫体SjHAT1的表达水平,检测DW-3-15、PZQ和姜黄素组虫体组蛋白H3、H4乙酰化水平及总H3、H4表达水平。结果:1.经100 μM DW-3-15、姜黄素及PZQ体外作用72 h后,DW-3-15处理组的雌虫和雄虫SjHAT1表达水平较正常对照组均显著下调（P＜0.01;P＜0.05）,姜黄素处理组的雌虫和雄虫SjHAT1表达水平同样呈显著下调趋势（P＜0.01;P＜0.001）,而PZQ处理组雌虫和雄虫SjHAT1表达水平与对照组相比无显著差异。2.经不同浓度 SjHAT1-dsRNA 作用 72 h 后,5 μg/mL、20 μg/mL 和 40μg/mL浓度组雌虫SjHAT1表达水平均显著低于正常对照组雌虫（P＜0.01;P＜0.05;P＜0.01）,而10 μg/mL浓度组雌虫SjHAT1表达水平仅轻度下调,无显著性差异。日本血吸虫雄虫经不同浓度SjHAT1-dsRNA作用72 h后,5 μg/mL和40 μg/mL浓度组雄虫SjHAT1表达水平均显著低于正常对照组雄虫（P＜0.01;P＜0.01）,而10 μg/mL和20 μg/mL浓度组的雄虫SjHAT1表达水平呈上调趋势,但无统计学差异。（不同浓度组间虫体SjHAT1表达水平的差异已在讨论中叙述）3.经100 μM DW-3-15、姜黄素及PZQ体外作用72 h后,DW-3-15处理组雄虫H3、H4乙酰化水平均显著下降（P＜0.05;P＜0.001）,雌虫H3乙酰化水平较对照组无显著差异,而雌虫H4乙酰化水平显著上调（P＜0.001）。另一方面,DW-3-15处理组雌虫、雄虫的总H3及总H4表达水平都呈下调趋势,其中雄虫总H3表达水平下调不显著;姜黄素处理组雌虫和雄虫H3乙酰化水平与对照组相比无显著差异,而H4乙酰化水平显著下调（P＜0.05;P＜0.001）。另一方面,姜黄素处理组雌虫、雄虫的总H3和总H4表达水平均显著上调（P＜0.05;P＜0.05;P＜0.001;P＜0.01）;PZQ处理组雌虫、雄虫的H3及H4乙酰化水平均显著下调（P＜0.01;P＜0.01;P＜0.05;P＜0.001）,而总H3和总H4表达水平与对照组相比均无显著差异。（不同组间虫体H3、H4乙酰化水平及总H3、H4表达水平的差异已在讨论中叙述）结论:实验结果提示DW-3-15可能通过抑制SjHAT1的转录和表达,改变了虫体的H3和H4乙酰化水平,从而影响了组蛋白的合成和染色质复制,进而影响了虫体的正常生存。