奶牛乳腺炎是危害奶牛健康、制约奶业发展和影响奶制品安全的头号疾病,可给畜牧业带来重大经济损失并影响人们生活质量。奶牛乳腺炎致病因素复杂、病理机制不明且缺乏安全有效的防治策略。传统观点认为奶牛乳腺炎主要是病原体入侵乳腺导致的局部炎症,但在生产实践中,奶牛乳腺炎常继发或伴发于以胃肠道菌群紊乱为特征的消化道疾病。课题组前期实验结果也表明:在小鼠模型中,肠道菌群紊乱可诱发乳腺炎并增加病原感染诱导乳腺炎的严重性;在奶牛上,过食高精料诱导胃肠道菌群紊乱同样增加乳中体细胞数（SCC）,导致乳腺炎。特别是肠道菌群及其代谢物介导的“肠-乳腺轴”的提出,进一步表明乳腺炎的发生除与病原菌感染乳腺有关外,尚存在肠源性致病途径,但潜在机制尚不清楚。因此,本研究首先通过分析奶牛乳腺炎临床病例,确证肠道菌群与乳腺炎的相关性;其次通过奶牛到小鼠的粪便微生物移植（FMT）,探究肠道菌群紊乱与乳腺炎的因果关系;随后通过对不同FMT小鼠的屏障功能、系统性炎症和细菌迁移等特征进行研究,探索肠道菌群紊乱通过“肠-乳腺轴”诱发乳腺炎的潜在机制;最后通过补充肠道共生菌及其代谢产物,验证调控肠道菌群防治“肠源性乳腺炎”的有效性。首先,收集临床型乳腺炎奶牛和健康奶牛的粪便、血液和乳汁样品,通过检测发现,乳腺炎奶牛血清总蛋白和球蛋白数量增加,白球比升高,碱性磷酸酶浓度降低,细胞因子TNF-α和IL-1β以及LPS浓度增加,表明乳腺炎奶牛伴随着系统性炎症;通过16S r RNA测序发现,乳腺炎奶牛肠道菌群多样性、结构和功能均发生改变,包括Escherichia＿Shigella在内的机会致病菌丰度增加,而Roseburia和Coprococcus等短链脂肪酸（SCFA）产生菌丰度降低。并且,奶牛血清TNF-α、IL-1β、LPS和乳中SCC与Escherichia＿Shigella呈正相关,而与Roseburia呈负相关。此外,乳腺炎奶牛乳汁中Escherichia＿Shigella丰度增加,并与乳汁SCC呈正相关。这些结果表明,乳腺炎奶牛发生肠道菌群紊乱,肠道Roseburia等SCFA产生菌减少,而致病性Escherichia＿Shigella同时在肠道和乳汁富集,并与系统性炎症和乳腺炎有关。其次,将健康和乳腺炎奶牛的粪便微生物移植给抗生素清除菌群小鼠,通过检测发现,与对照和移植健康奶牛粪便微生物（H-FMT）的小鼠相比,移植乳腺炎奶牛粪便微生物（M-FMT）破坏小鼠乳腺结构,增加乳腺TNF-α、IL-1β和MPO活力水平,促进CD11b+Gr-1+、CD11b+F4/80+、CD3+和CD3-CD49b+细胞在乳腺募集,降低乳腺紧密连接（TJ）蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-3表达,上调小鼠乳腺与炎症反应、LPS反应、细菌反应和免疫过程相关基因的表达,增加与炎症反应、NF-κB介导TNF产生、KRAS相关基因集的表达,上调乳腺TLR4、c GAS-STING、NF-κB、NLRP3信号相关蛋白的水平。这些结果表明,M-FMT促进小鼠乳腺炎发生和血乳屏障破坏,并与LPS和细菌介导的炎性信号激活有关。随后检测发现,M-FMT导致回肠、结肠和肝脏炎性细胞浸润,增加结肠TNF-α、IL-1β、IL-6、CCL2基因表达和粪便脂质运载蛋白2（LCN2）水平,降低结肠粘蛋白水平、杯状细胞数量、TJ蛋白表达,增加肠道通透性和血清TNF-α、IL-1β、ALT、AST和LPS水平。16S r RNA测序发现,M-FMT显著改变小鼠肠道菌群结构和细菌功能,Escherichia-Shigella等机会致病菌丰度增加,而共生Roseburia丰度降低。并且,Escherichia-Shigella与乳腺TNF-α、IL-1β和MPO活力、结肠炎性基因、粪便LCN2、血清细胞因子和LPS等呈正相关,而与结肠ZO-1、Occludin和Claudin-3呈负相关。与此相反,Roseburia与TJ蛋白呈正相关,而与炎症指标呈负相关。相似地,M-FMT改变小鼠乳腺菌群,增加乳腺Escherichia-Shigella丰度,并与乳腺炎症指标和免疫细胞数量呈正相关。此外,M-FMT促进乳腺致病性大肠杆菌从肠道向乳腺迁移,而使用环丙沙星清除肠杆菌科细菌缓解M-FMT导致的小鼠乳腺炎和系统性炎症。这些结果表明,肠道菌群紊乱通过破坏肠道屏障、引起系统性炎症和促进细菌跨“肠-乳腺轴”迁移,导致乳腺炎发生。最后,通过给M-FMT小鼠补充乳腺炎奶牛和M-FMT小鼠中减少的Roseburia,发现Roseburia intestinalis（R.intestinalis）缓解M-FMT小鼠的乳腺组织损伤,降低乳腺TNF-α、IL-1β和MPO活力水平,增加乳腺TJ蛋白表达,下调M-FMT小鼠乳腺与炎症反应、LPS反应、细菌反应和免疫过程相关基因的表达,并抑制TLR4、c GAS-STING、NF-κB和NLRP3相关蛋白表达。此外,R.intestinalis处理降低M-FMT小鼠粪便LCN2、血清细胞因子和LPS水平,增加结肠MUC2和TJ蛋白表达,降低肠道通透性。进一步检测发现,乳腺炎奶牛和M-FMT小鼠粪便丁酸水平降低,并与炎症指标呈负相关,而与肠道Roseburia丰度呈正相关。补充丁酸缓解M-FMT导致的小鼠乳腺组织损伤,降低乳腺细胞因子和MPO活力,增加TJ蛋白表达,下调乳腺与炎症反应、LPS反应、细菌反应和免疫过程相关基因的表达,抑制TLR4、c GAS-STING、NF-κB和NLRP3相关蛋白表达。R.intestinalis和丁酸补充还改变M-FMT小鼠肠道和乳腺菌群组成和功能,降低肠道和乳腺Escherichia-Shigella丰度,并抑制细菌从肠道向乳腺迁移。这些结果表明,共生Roseburia可通过产生丁酸调节肠道菌群稳态和屏障功能,抑制细菌跨“肠-乳腺轴”迁移,从而缓解系统性炎症和乳腺炎。综上所述,本研究证实奶牛乳腺炎存在肠源性致病途径。具体机制为:肠道菌群紊乱导致Roseburia等共生菌丰度降低,减少肠腔丁酸水平,促进机会致病性Escherichia-Shigella扩增和LPS产生,破坏肠道屏障,机会致病菌和LPS进一步通过损伤的肠道屏障进入血液,随血液循环到达乳腺并在乳腺积聚,破坏血乳屏障,激活TLR4介导的炎性信号并产生促炎细胞因子,导致乳腺炎发生。该研究结果不仅为深入破解乳腺炎的发病机制提供实验依据,同时为靶向肠道菌群开发防治奶牛乳腺炎的潜在药物提供重要理论指导。