【摘 要】
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在哺乳动物卵泡发育过程中,大多数卵泡退化闭锁而无法排卵,造成遗传资源的浪费,研究表明,卵巢颗粒细胞自噬是造成卵泡闭锁的关键因素之一,但是诱导颗粒细胞自噬的因素还不明确。在不同类型细胞中,海藻糖可以作为一种自噬诱导剂,通过诱导细胞自噬而发挥保护作用,但其在卵泡发育过程中的作用机制还不清楚。本次研究以猪卵巢颗粒细胞（PGCs）为研究对象,探讨海藻糖对PGCs的影响及作用机制,主要研究结果如下:一、海藻
【基金项目】
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陕西省重点研发计划（2020FP-001）； 陕西省区域创新能力引导计划-区域创新能力引导计划（2021QFY10-04）；
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在哺乳动物卵泡发育过程中,大多数卵泡退化闭锁而无法排卵,造成遗传资源的浪费,研究表明,卵巢颗粒细胞自噬是造成卵泡闭锁的关键因素之一,但是诱导颗粒细胞自噬的因素还不明确。在不同类型细胞中,海藻糖可以作为一种自噬诱导剂,通过诱导细胞自噬而发挥保护作用,但其在卵泡发育过程中的作用机制还不清楚。本次研究以猪卵巢颗粒细胞（PGCs）为研究对象,探讨海藻糖对PGCs的影响及作用机制,主要研究结果如下:一、海藻糖对体外培养PGCs的影响1.利用0.01,0.1,1,10和100 mM的海藻糖分别处理PGCs 8 h,16 h,24 h,结果显示,各处理组之间的细胞活率没有显著差异;2.海藻糖处理细胞16 h时,0.1 mM海藻糖显著增加细胞培养液中雌二醇（E2）的含量,同时1 mM海藻糖处理组的E2含量显著高于100 mM处理组。在海藻糖处理组中孕酮（P4）含量均显著高于对照组;1 mM海藻糖处理24 h的细胞P4含量也显著上调;处理16 h时,与100 mM的海藻糖作用相比,1 mM海藻糖显著上调StAR、FSHR、PGR的mRNA水平。处理24 h时,与对照组相比,PGCs的StAR、FSHR、PGR的转录水平极显著上升,16 h处理组的StAR转录水平也显著高于对照组。3.1 mM海藻糖处理16 h促进PGCs自噬基因ATG3、ATG7、BECN、LC3和LC3-Ⅱ蛋白的表达,下调p62蛋白的表达,同时增加细胞中自噬小体的数量。由以上结果可知,海藻糖调控PGCs的激素分泌并促进细胞自噬。二、海藻糖影响PGCs的转录组学研究1.对海藻糖处理的PGCs进行全转录组测序研究,一共鉴定出279个差异表达基因,其中上调的89个,下调的有190个;通过GO分析和KEGG信号通路分析,CYP1A1、PTGS2、NRBF2、DDIT4、BNIP3、ATG9B、NOS3、FOS富集在类固醇激素生物合成和自噬等通路上。2.筛选得到6条差异表达的miRNAs,分别是hsa-miR-98-3p＿1ss22CT、ssc-miR-221-5p＿R-4、ssc-miR-184、ssc-miR-362＿R-1、ssc-miR-660和PC-3p-68235＿30。3.利用qRT-PCR对随机选择的差异表达基因和miRNAs进行了验证,基因表达结果与测序结果相符。综合其差异表达的显著性,决定对miR-221-5p-R-4调控PGCs自噬开展深入研究。三、miR-221-5p＿R-4通过NRBF2介导PGCs自噬1.PGCs中miR-221-5p＿R-4类似物（mimic）显著上调自噬蛋白LC3-Ⅱ的表达而抑制p62的表达,抑制miR-221-5p＿R-4后LC3-Ⅱ表达被抑制,而p62蛋白表达上调,表明miR-221-5p＿R-4的表达促进自噬。2.利用Target Scan（v5.0）、miRanda（v3.3a）软件和双荧光素酶报告试验证明了miR-221-5p＿R-4能靶向结合自噬相关基因NRBF2;在PGCs中miR-221-5p＿R-4负调控NRBF2蛋白的表达。3.在PGCs中沉默NRBF2时,自噬相关基因Vps34的mRNA水平下降,自噬蛋白LC3-Ⅱ的表达上调,Beclin1蛋白表达下调,表明沉默NRBF2会影响自噬。抑制miR-221-5p＿R-4表达的同时沉默NRBF2,NRBF2的沉默逆转了miR-221-5p＿R-4对自噬的调节作用。综上所述,在PGCs中,1 mM海藻糖处理16 h对能够显著促进PGCs的功能,促进细胞自噬;海藻糖通过促进miR-221-5p＿R-4的表达来抑制NRBF2蛋白水平而调控PGCs自噬。试验结果为海藻糖在猪卵泡发育中的作用机制研究提供了理论支持。
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