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胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,是全球第三大与癌症相关的死亡原因。我国是胃癌高发国家,发病和死亡例数均约占世界的50%。化疗对晚期胃癌患者的生存率有所改善,但即使用最佳化疗联合方案,胃癌的中位生存期仍不到1年。ToGA研A究显示,曲妥珠单抗联合5-FU和铂类的治疗方案能够明显提高晚期或转移性HER2阳性胃/胃食管交界处腺癌患者的中位总生存(OS)。2010年,欧盟和美国相继批准曲妥珠单抗联合化疗用于晚期或转移性HER2阳性胃/胃食管交界处腺癌的一线标准治疗。然而,大多数胃癌患者对曲妥珠单抗联合化疗缺乏敏感性。一些研究报道了临床试用阿帕替尼与曲妥珠单抗联合治疗晚期胃癌患者,取得明显的疾病缓解,且晚期转移性胃癌对两种靶向药物具有较好的耐受性。目前尚不明确阿帕替尼联合曲妥珠单抗治疗胃癌的相关分子机制。目的:观察阿帕替尼联合曲妥珠单抗杀伤胃癌细胞NCI-N87的协同增敏作用并探索其作用机制。拟通过此实验为临床试用阿帕替尼联合曲妥珠单抗治疗晚期胃癌提供理论基础。方法:以胃癌NCI-N87细胞为观察对象,分别接受曲妥珠单抗、阿帕替尼和曲妥珠单抗+阿帕替尼联合处理。采用MTT法检测NCI-N87细胞对曲妥珠单抗、阿帕替尼的敏感性;CCK-8法检测曲妥珠单抗、阿帕替尼和曲妥珠单抗联合阿帕替尼对NCI-N87细胞的增殖抑制作用,q值判断联合用药效果;细胞克隆形成实验检测各加药组对NCI-N87细胞的增殖抑制率。流式细胞术分别检测各组药物对NCI-N87细胞凋亡和细胞周期的影响,Western blotting检测各组药物对NCI-N87细胞表达HER2、VEGFR2、BAX、Bcl-2和p53蛋白水平的影响。结果:1、MTT实验结果显示,曲妥珠单抗对胃癌NCI-N87细胞的增殖抑制率呈现浓度依赖性和时间依赖性(P<0.05)。阿帕替尼对胃癌NCI-N87细胞的增殖抑制率,在一定浓度范围内,呈浓度依赖性和时间依赖性。2、CCK-8法检测结果显示,各浓度组两种药物联合后对NCI-N87细胞的增殖抑制率均较单药组明显增加(P<0.05)。q值计算结果显示,24h、48h曲妥珠单抗(0.1μg/ml)与阿帕替尼(1μmol/L)有协同抑制NCI-N87细胞增殖的作用;72h曲妥珠单抗(0.1μg/ml)与阿帕替尼(1μmol/L)联合呈相加作用。3、细胞克隆形成实验检测结果提示曲妥珠单抗(0.1μg/ml)与阿帕替尼(1μmol/L)联合较各单药组抑制NCI-N87细胞增殖的作用明显增强(P<0.01)。4、Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测曲妥珠单抗组、阿帕替尼组及曲妥珠单抗+阿帕替尼组均能诱导NCI-N87胃癌细胞的凋亡,且联合组NCI-N87胃癌细胞凋亡较单药组明显增强(P<0.05)。采用流式细胞术检测细胞周期结果显示,阿帕替尼、曲妥珠单抗单药及二者联合均明显增加胃癌NCI-N87细胞G1期分布(P<0.05),且联合组较单药组G1期细胞增加明显(P<0.01),而S期和G2期细胞均相应减少。5、Western blotting检测,曲妥珠单抗组较空白对照组明显下调HER2蛋白的表达,而阿帕替尼组HER2的表达与空白对照组无明显差异,曲妥珠单抗+阿帕替尼组与空白对照组、曲妥珠单抗及阿帕替尼单药组相比,显著下调HER2蛋白的表达(P<0.05);曲妥珠单抗、阿帕替尼单药组较空白对照组Bcl-2蛋白的表达无明显降低,但联合组较空白对照组Bcl-2蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),且Bcl-2/BAX 比值明显降低(P<0.01)。曲妥珠单抗联合阿帕替尼可显著增加细胞内p53蛋白表达量(P<0.01)。但是,VEGFR2蛋白的表达在各组之间无明显差异。结论:阿帕替尼联合曲妥珠单抗可能通过下调HER2蛋白及调控凋亡相关蛋白Bcl-2、BAX的表达,增加细胞内p53蛋白表达,增加G0/G1期阻滞,协同抑制NCI-N87细胞增殖和促进细胞凋亡。