萝卜高密度遗传图谱构建与红皮性状基因鉴定

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高密度遗传图谱是提高参考基因组组装、基因定位、比较基因组研究的重要工具。萝1、(Raphanus sativus L.)是一种重要的一、二年生十字花科根菜类蔬菜作物。萝卜肉质根营养丰富,药用食疗价值高,不同基因型萝卜品种品质性状存在显著的差异。基于传统分子标记构建的萝卜遗传图谱,由于标记密度低,可利用的功能标记偏少,极大程度上限制了萝卜重要品质性状的基因定位研究。鉴于此,本研究以萝卜高代自交系‘NAU-LB’(白色长圆柱形)和‘NAU-YH’(红色小圆球形)为亲本配制F2群体,通过全基因组重测序与基因分型技术构建萝卜高密度遗传图谱,并对11个品质性状进行了 QTL定位;通过构建的F2、BC1P1和BC1P2作图群体进行遗传分析表明根皮色性状是由单基因控制;基于萝卜三个转录组数据鉴定可变剪切、SNP、InDel、SSR标记;结合BSA-seq与精细作图技术定位红皮基因;主要研究结果如下:1.对‘NAU-LB’、‘NAU-YH’和137个F2单株进行全基因组重测序分别获得了 5.63Gb、7.46Gb、404.44Gb的原始数据。利用BWA软件,将两个亲本测序数据比对到萝卜参考基因组,利用GATK软件在两个亲本中开发了 2,569,469个多态性位点,其中821,217个SNPs为双亲都是纯合的“aa×bb”型。基于F2群体基因型分型数据,通过遗传连锁分析,最终构建了一张包含2852个bin标记(378,738个SNPs),总长为1306.8cM,标记的平均距离为0.46cM的高密度遗传图谱。构建的萝卜高密度图谱比对得到萝卜参考基因组,结果揭示标记的相对位置与物理图谱具有较高的共线性。其中1号和7号连锁群发生了一定程度的重组,可用于提高萝卜基因组组装的准确性。共线性分析表明,萝卜染色体R8、R9与白菜染色体A08和甘蓝染色体C9显示出较高的保守同线性,其他染色体与白菜和甘蓝共线性关系较低,说明基因组之间发生了染色体重排,为揭示萝卜特定的基因组结构提供理论基础。将遗传图谱比对到物理图谱计算重组率,重组在染色体上呈现不均匀分布。总共鉴定到504个重组热区,主要富集在基因的启动子和终止子附件。重组率与SNP密度,基因密度和GC含量显示正相关。功能注释分析表明,重组热区内基因主要参与代谢物过程。利用MapQTL软件的多重QTL模型作图法对皮色、根宽、根长、根重、可溶性蛋白等11个性状进行QTL位点分析,总共检测到18个QTLs位点;LOD值介于2.55-6.92之间,分布于LG1、LG2、LG4、LG5和LG8五条连锁群上,单个QTL表型变异解释率(R2)介于8.1%-21.2%。每条连锁群检测到QTL数目介于1-5个,其中2号连锁群检测到的QTL数目最多,达到7个。2.以‘NAU-LB’(白皮萝卜)和‘NAU-YH’(红皮萝卜)构建的F2、BCiP1和BC1P2三个作图群体对萝卜红皮性状进行遗传分析,卡方检验表明其为单基因控制的质量性状。通过BSA-seq分析将候选区间定位到7号染色体9.0Mb-1 1.6Mb区段。利用3个萝卜转录组数据集比对到萝卜参考基因组,总共鉴定到56,530个可变剪切事件,其中内含子保留事件为最主要的类型,占萝卜基因总数的59.4%。鉴定到了 22,412个SNP和9436个InDel,非同义与同义突变SNP的比是1.05:1。基于31,604个unigenes序列,检测到43,680个潜在SSR位点。此外,随机选取35个SNP和200个InDel,Sanger测序分析表明,83.9%SNP和70%InDel在三种基因型中呈现出多态性,15个SNP和125个InDel不均匀分布在9条连锁群中。利用3个标记和112个白色根皮单株进行精细定位,将候选基因定位于InDe18和InDel11之间,物理距离为74kb,研究结果与高密度遗传图谱进行红皮基因区间一致。目标区间内存在一个基因属于R2R3-MYB转录因子家族成员,与拟南芥AtMYB90 CDS序列同源性最高。RsMYB90基因组DNA全长为1315bp。定量和半定量RT-PCR结果发现RsMYB90基因在‘NAU-YH’肉质根中呈现高水平表达,表明该基因可能为控制萝卜红皮性状形成的重要功能因子。研究结果为深入解析红皮性状形成分子机制提供了重要基础,也为选育高花青素累积萝卜品种提供了理论依据。
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