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背景与目的多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）是育龄期女性最常见的内分泌和代谢疾病之一,国内外患病率约在5%-20%之间。PCOS主要表现为卵巢功能障碍和雄激素过多,包括稀发排卵、卵巢多囊样改变、高雄激素血症、多毛、痤疮等,常与代谢综合征、肥胖、胰岛素抵抗有关,甚至可能出现焦虑抑郁、心脑血管疾病、2型糖尿病、子宫内膜癌等远期并发症,异质性是其最重要的特点。PCOS的病因及发病机制至今仍不明确,有学者认为PCOS是一种复杂的多基因疾病,受遗传与环境因素作用。目前PCOS没有针对性治疗方法,只能通过对抗雄激素、调整月经周期、促排卵或诱导排卵、体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET）等对症治疗措施。细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EV）是一种可介导组织内或组织间细胞通讯的纳米级膜囊泡,能转运DNA、RNA、脂质、蛋白质等各种内容物,是目前肿瘤等研究领域聚焦的热点。外泌体（Exosomes）是EV的一种,可存在于输卵管上皮、卵泡液、子宫内膜、子宫宫腔冲洗液、胚胎培养基等中。作为一种能包裹信号分子在细胞间传递的纳米小体,外泌体在卵泡生长、受精卵形成、胚胎着床、胚胎发育等生理病理过程中发挥作用。卵泡液是卵巢颗粒细胞、卵母细胞等生长发育的微环境,其内含有的类固醇激素、生长因子等多种成分,可为卵泡生长发育提供所需物质,颗粒细胞是卵母细胞周围重要的细胞群,与卵母细胞间存在密切的物质交换。微小核糖核酸（MicroRNA,miRNA）是一类具有21-22个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子,广泛存在于人体中,可与信使RNA（messenger RNA,mRNA）3’端非翻译区结合来调节转录后基因表达,已发现其在PCOS人群卵泡液、血清、脂肪组织、颗粒细胞、外周血白细胞中存在异常表达,可能在PCOS疾病进展中发挥重要作用。卵泡液中的外泌体可能通过传递miRNA等内容物,参与卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞、卵母细胞间的细胞间通讯,影响卵泡发育等生理病理过程。miR-199a-3p主要与肝癌、卵巢癌、2型糖尿病有关,mTOR是其文献报道的靶基因之一。目前据我们所知还没有文献报道过miR-199a-3p与PCOS发病机制的关联。本研究选取外泌体miR-199a-3p作为研究对象,分析其在非PCOS人群与PCOS人群卵泡液外泌体中差异表达情况,并通过对样本临床资料的相关性分析、生物信息学分析、体外细胞实验等方面探究miR-199a-3p与PCOS发病机制的可能关联,旨在发现PCOS病理生理过程中的潜在作用因子,为寻找可能的治疗靶点提供新思路。材料与方法本研究选取郑州大学人民医院生殖医学中心2020年12月至2021年4月首次行IVF-ET助孕的PCOS患者与因输卵管因素首次行IVF-ET助孕的非PCOS对照者,签署知情同意后收集患者临床资料与卵泡液样本,用ExoQuick外泌体提取试剂盒提取外泌体,并对其特征进行鉴定。用miRNA提取试剂盒提取纯化卵泡液外泌体中miRNA,通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-199a-3p相对表达量,对临床数据进行相关性分析并绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）。利用在线数据库对 miR-199a-3p靶基因及功能进行预测,在人卵巢颗粒细胞系（human ovarian granulosa cell line,KGN）中观察miR-199a-3p过表达组与抑制组细胞凋亡与细胞周期的改变情况,并通过qRT-PCR与蛋白免疫荧光实验探索miR-199a-3p与潜在靶基因mTOR的关系。结果1.利用透射电子显微镜、粒径分析、Western-Blot对所提外泌体进行鉴定,结果显示提取物符合文献对外泌体特征的描述。2.与对照组相比,PCOS组卵泡液外泌体miR-199a-3p的相对表达量显著上调（P＜0.001）,且与 AMH（P＜0.001）、AFC（P=0.005）、基础 LH（P=0.003）、LH/FSH（P＜0.001）、基础T（P=0.013）存在正相关关系。3.卵泡液外泌体miR-199a-3p相对表达量高于2.49时预测PCOS的敏感度为86.7%,特异度为86.7%,预测行IVF-ET助孕的PCOS患者中2PN数低者、D3可利用胚胎数低者、D3优质胚胎数低者时的截断值分别为2.49、3.57、2.49,ROC曲线下面积均高于0.70。4.利用4个在线生物信息数据库预测miR-199a-3p靶基因交集共有55个（包括mTOR）,GO/KEGG功能注释分析显示主要与DNA模板的转录与转录调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录负调控、蛋白结合、转录因子结合、MAPK及PI3K-AKT信号通路有关。5.在KGN细胞系中分别转染miR-199a-3p的mimics（过表达组）、inhibitor（抑制组）、NC（阴性对照组）后发现,与抑制组相比,过表达组的细胞凋亡率下降（P=0.030）,细胞周期S期比例上升（P=0.032）;过表达组中mTOR的mRNA 表达下调（P=0.021）,mTOR 蛋白（P=0.387）与 p-mTOR 蛋白（P=0.047）蛋白免疫荧光值均下调。结论1.PCOS患者卵泡液外泌体miR-199a-3p表达上调,其表达与患者AMH、AFC、基础LH、LH/FSH、基础T呈正相关。2.miR-199a-3p表达上调可抑制KGN细胞凋亡、促进细胞增殖,可能通过靶向mTOR影响相关信号通路参与PCOS的发病过程。