【摘 要】
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研究背景肺癌是一种很常见的恶性肿瘤,其每年的发病率和病死率位居世界各大肿瘤的第一位。肺癌种类多样,治疗难度大,预后差。因此,寻找更有效的治疗靶点和诊断标志物具有临床迫切性,同时对于肺癌发生发展中具体机制的研究将有利于其诊治。近年来,环状RNA（circular RNA,circRNA）成为生物医学研究的热点,其具有物种保守性、稳定性和表达特异性,在肿瘤等疾病发生过程中发挥重要的调控作用,有望成为临
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研究背景肺癌是一种很常见的恶性肿瘤,其每年的发病率和病死率位居世界各大肿瘤的第一位。肺癌种类多样,治疗难度大,预后差。因此,寻找更有效的治疗靶点和诊断标志物具有临床迫切性,同时对于肺癌发生发展中具体机制的研究将有利于其诊治。近年来,环状RNA（circular RNA,circRNA）成为生物医学研究的热点,其具有物种保守性、稳定性和表达特异性,在肿瘤等疾病发生过程中发挥重要的调控作用,有望成为临床诊断治疗的新靶点和标志物。目前,对于circRNA在肺癌中的研究已有一定进展,但还需要更多和更深入的研究探讨,期望为肺癌的诊治提供更可靠的理论支持。因此,本研究针对肺癌中低表达的circFOXP1展开具体的体内外实验,探讨其作用的具体分子机制。研究方法第一部分:circFOXP1在肺癌细胞中的作用。1.荧光定量PCR检测circFOXP1在各种肺癌细胞系中的表达水平。2.构建circFOXP1过表达载体转染肺癌细胞,荧光定量PCR检测其过表达水平。3.CCK-8法检测circFOXP1对肺癌细胞增殖活性的影响。4.流式检测circFOXP1对肺癌细胞凋亡水平的影响。5.Transwell法检测circFOXP1对肺癌细胞侵袭能力的影响。第二部分:circFOXP1竞争性吸附miR-558而促进下游靶基因TNFAIP1和TPM1的表达。1.核质分离检测circFOXP1的细胞表达定位。2.筛选与circFOXP1结合的miRNAs。3.双荧光素酶报告基因实验检测circFOXP1与miR-558的结合。4.RNA-pull down检测circFOXP1与miR-558在胞内是否直接结合。5.免疫共沉淀检测circFOXP1、miR-558与AGO2蛋白结合能力。6.荧光定量PCR检测miR-558在各种肺癌细胞系中的表达水平。7.miR-558靶基因筛选。8.双荧光素酶报告基因实验检测miR-558与靶基因TNFAIP1、TPM1的结合。9.荧光定量 PCR 检测 circFOXP1、miR-558 对靶基因 TNFAIP1、TPM1 的表达影响。10.Western blot 检测 circFOXP1、miR-558 对靶基因 TNFAIP1、TPM1 的表达影响。第三部分:circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路抑制肺癌进展。1.circFOXP1过表达载体、miR-558模拟物或抑制物、TNFAIP1或TPM1的过表达载体或siRNA分别转染或共转染肺癌细胞。2.CCK-8法检测肺癌细胞增殖活性水平。3.流式检测肺癌细胞凋亡水平。4.Transwell法检测肺癌细胞侵袭能力。5.筛选稳定高表达circFOXP1或miR-558的A549细胞。6.构建裸鼠成瘤模型。7.记录瘤组织生长曲线和体积。8.荧光定量 PCR 检测 circFOXP1、miR-558、TNFAIP1、TPM1 的表达。9.Western blot检测TNFAIP1、TPM1的蛋白表达水平。研究结果第一部分:1.circFOXP1在肺癌细胞系中表达下调。2.circFOXP1抑制肺癌细胞的增殖活性。3.circFOXP1促进肺癌细胞的凋亡发生。4.circFOXP1抑制肺癌细胞的侵袭能力。第二部分:1.circFOXP1主要表达于细胞质中。2.circFOXP1抑制miR-558在肺癌细胞中的表达。3.circFOXP1在肺癌细胞中与miR-558直接结合。4.miR-558高表达于肺癌细胞系中。5.TNFAIP1和TPM1均是miR-558的靶基因。6.miR-558能阻断circFOXP1促TNFAIP1和TPM1表达的作用。第三部分:1.circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路抑制肺癌细胞增殖活性。2.circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路促进肺癌细胞凋亡发生。3.circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路降低肺癌细胞侵袭水平。4.circFOXP1抑制肺癌裸鼠瘤的生长和大小。5.miR-558阻断circFOXP1抑裸鼠瘤生长的作用。6.circFOXP1通过miR-558促进TNFAIP1和TPM1在裸鼠瘤中的表达。研究结论1.circFOXP1在肺癌细胞中表达下调,而miR-558表达上调。2.circFOXP1通过竞争性结合miR-558而抑制miR-558表达,进而促进下游靶基因TNFAIP1和TPM1的表达。3.circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路抑制肺癌细胞增殖和侵袭,同时促进凋亡。4.circFOXP1通过miR-558/TNFAIP1、TPM1通路抑制肺癌裸鼠瘤的生长。
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