研究背景最近,大量研究表明长链非编码RNA linc00662在多种癌症中起着致癌基因的作用。然而,linc00662在结直肠癌（colorectal cancer CRC）中确切的肿瘤发生机制尚不清楚。在GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中,我们发现linc00662在CRC组织中高表达,而且在不可切除的结直肠癌组织中其表达量显著升高;在TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中,发现linc00662的表达程度与生存预后呈负相关,这提示linc00662是CRC一个致癌基因。因此,探究linc00662在CRC进展调控中的具体的生物学作用可能具有重要的临床意义。研究目的1.应用广东省人民医院胃肠外科组织标本库进一步来验证linc00662在CRC以及在癌旁组织中的表达情况;2.linc00662亚细胞定位于细胞浆,其具有作为竞争性内源性 RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）干扰 micro RNA（miRNA）的功能。利用生物信息学分析技术及双荧光免疫素酶实验鉴定linc00662下游调控的miR-497-5p以及其下游调控的靶基因AVL9;3.明确linc00662影响CRC细胞的增殖、凋亡和迁移能力的具体分子机制;4.利用回复实验明确linc00662、下游调控的miR-497-5p和下游调控靶基因AVL9三者的调控关系,从而阐明linc00662在CRC中发挥ceRNA作用的机制;5.利用生物信息分析技术及CRC患者组织及临床病理参数研究AVL9在CRC中表达情况,鉴定AVL9可作为CRC的预测生物标志物。研究方法1.利用GEO及TGCA公共数据库数据分析linc00662在CRC中的表达情况以及 linc00662 与生存预后的关系;2.RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）检测56例CRC患者的癌组织以及配对癌旁组织linc00662的表达情况,并进行临床病理参数分析;3.利用结直肠正常粘膜上皮FHC细胞株以及 CRC 细胞株 SW480、Caco-2、Lovo、HT-29、HCT116 进行体外实验,用qRT-PCR 方法检测 FHC 细胞株以及 CRC 细胞株 SW480、Caco-2、Lovo、HT-29、HCT116中linc00662的表达情况,进一步选取表达量最高的两株细胞株为实验对象,利用慢病毒转染小干扰RNA技术构建linc00662低表达细胞模型。然后通过细胞计数Kit-8（CCK-8）和体内实验去验证当敲低linc00662表达之后,两个细胞株的增殖能力,流式细胞学实验检验细胞的凋亡率和细胞周期的百分比,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,Western Blot实验检测各实验组中EMT相关蛋白的表达情况,裸鼠皮下成瘤实验检测转染后各组细胞增殖相关情况;4.通过starbase2.0预测miR-497-5p与linc00662有两个共同的连接位点。双荧光免疫素酶实验进一步验证linc00662与miR-497-5p的靶向关系。同时在miRtarscan,miRDB,targetscan human7.0三个在线生物信息学数据库筛选出miR-497-5p相关靶基因,用韦恩图取三个数据库共同预测出来的靶基因,并对其功能富集分析,鉴定出下游靶基因AVL9的功能,再次利用双荧光素酶实验进一步验证miR-497-5p与AVL9明确的靶向关系。5.最后利用回复实验验证linc00662、miR-497-5p 和 AVL9三者的调控关系。6.应用 GEO、TCGA、GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）数据库评估 AVL9 的表达水平,利用SurvExpress分析AVL9的临床生存预后。使用cBioPortal和LinkedOmics获得AVL9表达相关基因。用cytoscape 3.7.1软件分析蛋白相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络,用 DAVID6.8 软件对基因本体（Gene Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）信号通路进行富集。使用在线工具（proteinatlas）免疫组化检测CRC中AVL9的表达情况。采用RNA分离和逆转录定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测组织和血清标本中AVL9的表达;7.采用SPSS24.0软件对实验数据进行分析,GraphPad Prism 7.0对实验数据进行图表展示,其中P<0.05说明结果具有统计学意义。本研究结果分为以下四个部分第一部分:linc00662在CRC中高表达且与临床预后呈负相关前期为探索linc00662在CRC中的表达及其与临床预后的相关性,我们首先在 GEO 数据库中的数据集（GDS3141,GDS4379,GDS4381 GDS4718,GDS4516,GDS4393,GDS3501）,我们发现 linc00662 表达 CRC 组织高于正常粘膜组织,进一步分析研究发现,在不可切除的CRC组织,linc00662表达更是显著增加。我们从TCGA-COAD数据集下载225例结肠癌患者的临床数据。根据linc00662的中位表达水平,我们将患者分为低表达组（135例）和高表达组（90例）。数据分析显示,过表达linc00662患者的总生存期（OS）明显缩短（P=0.037）。采用RT-PCR检测56例CRC组织及配对正常癌旁粘膜中linc00662的表达水平。同样,CRC组织中linc00662的表达高于正常结肠粘膜,CRC组织样本中有77.8%（56对中的43对）出现linc00662过表达。根据linc00662表达的中位数,我们将CRC患者分为高表达组和低表达组。我们的数据进一步分析后表明,淋巴结转移阳性,TMN分期更差,和肿瘤分化更差的CRC患者linc00662表达水平更高。最后,在预后评估中,结果表明linc00662低表达式组存活时间比高表达组长（P=0.022）。第二部分.:Linc00662在CRC细胞系中表达上调;linc00662促进CRC细胞的迁移、侵袭和EMT（epithelial-mesenchymal transition）过程,进而促进肿瘤转移。为了进一步验证linc00662在CRC发展中的生物学作用,我们通过RT-qPCR检测linc00662在5个CRC细胞系和正常细胞系中的表达水平。结果证实,在所有CRC细胞系中,linc00662的表达显著增加,尤其是在SW480和Caco-2细胞系。因此,我们选择Caco-2和SW480细胞株进行以下研究。我们构建了以linc00662为靶点的两个siRNA和阴性对照（NC）siRNA,分别转染到 Caco-2 和 SW480 细胞中,命名为 sh-linc006621 和 sh-linc006622 和si-Control,RT-qPCR检测结果证实,在两个细胞系中linc00662的表达被下调。为了进一步评估linc00662对细胞增殖的潜在影响,我们在sh-linc00662转染后24、48、72和96小时进行了 CCK-8检测,结果表明,相对于对照组,敲除linc00662可以显著降低细胞存活率。流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比,下调linc00662后Caco-2和SW480细胞的早期凋亡率升高。细胞周期分析表明,敲除linc00662可以阻滞更多的细胞在G2/M期。为证明linc00662表达水平是否会在体内影响CRC的成瘤,我们将转染过的Caco-2和SW480细胞皮下接种于雄性裸鼠。21天后,我们发现sh-linc006621组的肿瘤体积明显小于siRNA-NC组（P<0.001）。与siRNA-NC组相比,sh-linc006621组的肿瘤重量也显著下降（P<0.001）。Transwell检测结果显示,linc00662表达的下调抑制了 Caco-2和SW480细胞的迁移和侵袭能力。上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是促进肿瘤细胞转移的重要途径。Western-Blotting数据显示,沉默linc00662可显著上调上皮标志物E-cadherin,下调间充质标志物N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白。因此,我们得出结论:linc00662促进CRC细胞的迁移、侵袭和EMT过程,进而促进肿瘤转移。第三部分:Linc00662通过调控miR-497-5p/AVL9轴来促进CRC的发生和发展根据starbase2.0软件检索的结果,我们发现包括miR-16-5p,miR-195-5p,miR424-5p和miR-497-5p在内的一系列microRNA具有与linc00662共同的两个共同位点。我们进一步进行了双荧免疫素酶实验以进一步测试这四个候选miRNA,而这些结果表明,在4个选定的miRNA中,miR-497-5p mimic可以最高效率抑制荧光素酶活性。通过文献综述,在先前的研究已经表明,miR-497-5p在肿瘤中明显低于正常组织,并且在CRC中起着抑癌基因的作用。同样,我们的数据显示,miR-497-5p在CRC组织中的表达低于正常组织（P<0.05）,并且69.6%（56个配对中的39个）的CRC组织样本的miR-497-5p呈下调状态。根据Pearson相关系数分析,miR-497-5p表达水平与CRC组织中linc00662表达负相关（r=-0.5134,P<0.001）。进一步行RT-qPCR检测,相对于正常结直肠细胞,CRC细胞系中的miR-497-5p表达明显下调。接下来,RT-qPCR检测显示敲低linc00662的表达可显著增加Caco-2和SW480细胞中miR-497-5p的表达。这些数据证实,linc00662可以通过海绵吸附miR-497-5p而发挥其作为致癌基因功能。为了进一步研究CRC中的ceRNA网络机制,应用了三个在线生物信息学数据库（包括 miRDB,targetscan Human 7.2 和 miRtarbase）来预测 miR-497-5p 的潜在靶基因,然后通过在线网络工具生成Venn图（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）来可视化三个数据库结果之间的相交基因。从Venn结果中鉴定出17个潜在的miR-497-5p靶基因（KANK1 SALL1 CBX4IPPK WNT7A ZNRF3 RECK ACVR2A CYP26B1 LURAP1L CCND2 CACUL1 SPRED1 CHAC1 AVL9 ZNF622 CDC25A）。我们进一步证实了它们在GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）中的表达水平,因为AVL9,CBX4,ZNRF3和CHAC14在CRC中显著表达上调。同时,通过基因功能富集（GO）分析,这17个基因在功能上集中于与肿瘤相关的细胞运动,细胞运转,细胞内细胞器和膜部分的生成等,而AVL9参与了所有这些功能。最后,还使用生物信息学数据库 RNA22（https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/）预测了miR-497-5p和AVL9潜在的结合位点,双荧光免疫素酶实验表明同时转染AVL9野生型和miR-497-5p的细胞中荧光素酶活性显著减弱。因此,我们认为AVL9可能是miR-497-5p的下游靶基因。为了确定CRC中linc00662和AVL9之间的ceRNA网络,我们做了进一步分析,TCGA-portal 数据库（http://tumorsurvival.org/）显示,AVL9 水平较高的CRC患者更可能具有较差的总体生存率（P=0.0246）。TCGA-portal数据库还显示linc00662的表达与AVL9的表达呈正相关（R=0.34,P<0.001）。此外,linc00662下调的SW480和Caco-2细胞显示,linc00662的表达下调可以显著降低两个细胞系中的AVL9 mRNA水平,而miR-497-5p抑制剂可以再次在linc00662-下调的CRC细胞中提高AVL9的表达。因此,我们认为linc00662可能通过与miR-497-5p结合并调节AVL9来调节抑制CRC增殖和转移的能力。为进一步证实linc00662、miR-497-5p和AVL9在CRC中的关系,我们研究探讨了 miR-497-5p和AVL9的功能,并尝试去调节SW480细胞中miR-497-5p和AVL9的表达,由于在转染sh-linc00662-1的SW480细胞对miR-497-5p和AVL9的表达具有较好的调节效果,故我们采用该细胞模型做进一步研究,结果再次发现,当SW480细胞株转染sh-linc00662-1之后,AVL9的表达在细胞中显著下调,但这种下调的情况可以被miR-497-5p抑制剂抵消。此外,同样,AVL9特异性siRNA（siRNA-AVL9）可以极大地降低SW480细胞中AVL9的表达。更有趣的是,CCK-8的结果表明,在转染了 sh-linc00662-1的SW480细胞中同时转染miR-497-5p抑制剂能促进的细胞生长,但其生长趋势又可以被siRNA-AVL9抑制。同样,在Transwell实验中可以发现miR-497-5p抑制剂可以逆转sh-linc00662-1诱导的抗迁移和侵袭作用。然而,转染了 siRNA-AVL9又可以抑制细胞的迁移和侵袭,因为从Transwell分析中观察到的迁移和侵袭细胞更少。因此,以上这些结果表明,AVL9可能是CRC发育过程中linc00662/miR-497-5p轴的靶基因。第四部分:AVL9在结直肠癌（CRC）中表达上调,可能作为结直肠癌的预测生物标志物通过GEO、TCGA、GEPIA数据库数据挖掘均证实AVL9在结直肠癌中比正常结直肠组织表达显著升高（P<0.001）。且在SurvExpress数据库中发现ALV9的高表达与生存预后呈负相关（P<0.05）。基因功能富集（GO）分析显示AVL9表达相关基因富集于单个机体细胞-细胞粘附、转录后调控基因表达、负调控血管内皮生长因子受体信号通路（P<0.05）,KEGG通路分析显示,这些基因主要参与肿瘤相关的卵母细胞成熟、轴突引导、胰岛素信号通路和泛素介导的蛋白水解信号通路（P<0.05）。蛋白与蛋白互作分析（PPI）显示KBTBD2、KIAA1147、EPDR1和RNF216基因与AVL9密切互作,在GEPIA数据库中预测它们的表达水平均与AVL9呈正相关,这提示它们共同促进肿瘤的进展。利用患者的临床病理参数分析发现AVL9高表达与肿瘤分化、TNM分期呈正相关。血清RT-qPCR检测进一步表明,与健康对照组相比,结直肠癌患者血浆中AVL9表达上调。这些结果表明,AVL9可能作为结直肠癌一种潜在的非侵入性诊断和治疗的生物标志物。结论1.长链非编码RNA Linc00662在CRC中显著上调,且与临床预后呈负相关;2.体内外实验结果表明长链非编码RNA Linc00662促进CRC细胞的迁移、侵袭和EMT过程,进而促进肿瘤转移;3.miR-497-5p既可以靶向长链非编码RNA linc00662,又可以靶向AVL9 mRNA,机制研究表明linc00662是通过海绵吸附miR-497-5p来竞争调节AVL9的表达参与CRC进展和转移。4.AVL9在结直肠癌（CRC）中表达上调作为致癌基因促进肿瘤的进展,可能作为一种非侵入性诊断和治疗的生物标志物。这些研究提示,我们的结果可能有助于CRC鉴定出新的诊断和治疗靶点。