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目的:组蛋白(去)乙酰化酶通过调控组蛋白乙酰化参与精子核浓缩与去浓缩过程,但组蛋白(去)乙酰化酶表达的调控机制仍有待进一步研究。本研究旨在探讨精子核浓缩与去浓缩过程中miRNAs对4种组蛋白乙酰化酶(histone acetylases或histone acetyltransferases,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)表达的调控作用,为进一步理解精子核浓缩与去浓缩提供一定理论基础,为健康生殖、物种繁衍和增产养殖等提供参考依据。方法:以浓缩核精子的小鼠和去浓缩核精子的河蟹的精巢组织为研究对象,利用高通量测序、实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)、免疫荧光(Immunofluorescence,IF)等技术,分析成鼠与幼鼠、成蟹与幼蟹精巢组织中差异表达的组蛋白(去)乙酰化酶,并利用Target Scan、miRanda和RNAhybrid等数据库综合预测靶向它们的micro RNAs(miRNAs),通过序列比对进一步找到两物种中靶向同一组蛋白(去)乙酰化酶的miRNAs。通过慢病毒转染敲低miRNAs的表达,观察其靶标基因及蛋白的表达变化,进一步分析其可能的靶向调控关系及其分子机制。结果:(1)赖氨酸乙酰转移酶8(K(lysine)acetyltransferase 8,KAT8/Kat8[斜杠后为小鼠中的书写方法,下同])、组蛋白乙酰转移酶1(histone aminotransferase 1,HAT1/Hat1)、组蛋白去乙酰酶复合物亚基SAP 30(Histone deacetylase complex subunit SAP30,SAP30/Sap30)和NAD依赖性蛋白去乙酰酶sirtuin-1(NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-1,SIRT1/Sirt1)这4个候选组蛋白(去)乙酰化酶在浓缩核小鼠和去浓缩核河蟹精巢组织中均有差异表达(P<0.05),表明它们均可能参与精子发生过程。(2)4个候选组蛋白(去)乙酰化酶,除HAT1/Hat1在两物种精巢组织中表达模式相同(即均在幼稚阶段精巢组织中下调,在成熟阶段精巢组织中上调)外,其余三个酶(KAT8/Kat8、SAP30/Sap30、SIRT1/Sirt1)在两物种精巢组织中表达模式均不相同。与幼稚阶段相比,成鼠睾丸组织中Kat8、Sap30、Sirt1均下调表达,而这三个蛋白在成蟹精巢组织中均上调表达。4个候选分子在m RNA水平上的表达与蛋白水平的表达一致。由于小鼠与河蟹精子核的浓缩态存在明显不同,那么这三个酶在精子核的浓缩与去浓缩中可能发挥着更为重要的作用。(3)4个候选组蛋白(去)乙酰化酶在河蟹和小鼠物种精巢组织中均主要定位于细胞核,但其在两物种不同雄性生殖细胞中的表达不尽相同:在去浓缩核河蟹中,KAT8、HAT1、SAP30以及SIRT1均在精原细胞中表达量最高,随着细胞的发育表达量下降,精子中表达量低。而在浓缩核小鼠中,该四个蛋白却在精原细胞和精子中均表达较高,在初级精母细胞、次级精母细胞及精子细胞三个中间阶段中较低。(4)4个候选组蛋白(去)乙酰化酶在河蟹和小鼠物种中的miRNAs预测及分析:(1)在去浓缩核河蟹中,鉴定出miR-9、novel-mir11、miR-133_3和miR-182分别为靶向KAT8、HAT1、SAP30和SIRT1的miRNAs,RT-q PCR显示它们均在成蟹与幼蟹精巢组织中差异表达,并且相对于幼蟹精巢组织,它们均在成蟹精巢组织中下调表达,而其各自的靶基因在成蟹精巢组织中上调表达,表明其极可能具有靶向调控关系。(2)在浓缩核小鼠中,鉴定出miR-9-5p、miR-125a-5p、miR-133a-3p和miR-183a-5p分别为靶向Kat8、Hat1、Sap30和Sirt1的miRNAs。Bio Edit序列比对显示,该4个miRNAs与河蟹中靶向同一基因的4个miRNAs(分别为miR-9、novel-mir11、miR-133_3和miR-182)具有极高的序列相似度(90%以上碱基一致)。RT-q PCR显示它们均在成鼠与幼鼠睾丸组织中差异表达,相对于幼鼠睾丸组织,miR-9-5p、miR-133a-3p和miR-183-5p在成鼠睾丸组织中表达上调,其各自靶基因表达下调;而miR-125b-5p在成鼠睾丸组织中表达下调,其靶基因表达上调,表明它们与各自的靶基因也极可能具有靶向调控关系。构建miR-9-5p敲减慢病毒转染小鼠精原细胞,经RT-q PCR和WB实验发现,miR-9-5p敲减后小鼠精原细胞中miR-9-5p明显下调,Kat8 m RNA和编码蛋白明显上调,这进一步说明了miR-9-5p与Kat8可能具有靶向调控关系。结论:(1)4种候选组蛋白(去)乙酰化酶在浓缩核小鼠和去浓缩核河蟹精巢组织中均可能参与精子发生过程,但作用可能不完全一样。(2)KAT8/Kat8、SAP30/Sap30、SIRT1/Sirt1可能是参与精子核浓缩与去浓缩的关键蛋白,而HAT1/Hat1则可能发挥其它功能,这还有待进一步研究。(3)4种靶向于候选组蛋白(去)乙酰化酶的miRNA,即miR-9-5p/miR-9(斜杠后为河蟹中的相应miRNA,下同)、miR-125a-5p/novel-mir11、miR-133a-3p/miR-133_3和miR-183a-5p/miR-182分别通过调控KAT8/Kat8、HAT1/Hat1、SAP30/Sap30和SIRT1/Sirt1在小鼠(成鼠与幼鼠)及河蟹(幼蟹和成蟹)精子发生中发挥作用,其中miR-9-5p/miR-9、miR-133a-3p/miR-133_3和miR-183a-5p/miR-182在精子浓缩和去浓缩中可能发挥着更主要的作用,不过它们的靶向调控关系后续还需要进一步验证。