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以转基因技术和体细胞核移植相结合的方法制备转基因动物是目前生产转基因家畜的主要技术手段。针对与肉质改良相关的基因,我们分别构建了CMV和CAG启动子驱动的n-3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因表达载体,并转染到绵羊胎儿成纤维细胞中。将得到的阳性转基因细胞用于体细胞核移植来制备转基因动物。结果得到的转基因克隆绵羊出现了两种不同的表达模式,为了探究可能导致其出现的原因,我们对两种启动子来源的转基因在细胞、胚胎和动物个体上进行了甲基化检测。1.CMV启动子驱动的转fat-1基因克隆绵羊的制备从线虫总RNA中分离得到了n-3不饱和脂肪酸的fat-1基因,将其连入CMV启动子驱动的表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中,使其和绿色荧光蛋白的基因共表达。转染并筛选绵羊胎儿成纤维细胞得到稳定表达外源基因的转基因细胞系,将其用作体细胞核移植的供体细胞。接着将转基因的重构胚移植到同期发情的受体蒙古羊的输卵管中。5个月后,两只克隆羊发育足月并产出,命名为H001和H002。PCR反应和Southern blots检测显示外源基因全长整合到了绵羊的基因组中。但在转基因羊的组织中却没有检测到fat-1mRNA的表达。对肌肉组织进行脂肪酸组成的分析也没有检测到外源基因的表达。这些结果表明外源的fat-1基因在转基因绵羊中发生了基因沉默。2.转pCMV-fat1基因克隆绵羊的甲基化分析将得到的两只转pCMV-fat1基因克隆绵羊H001和H002的各种组织进行CMV启动子区域的甲基化分析。经过软件分析,CMV启动子内部有3个CpG岛,选择最长的CpG岛作为甲基化测序的目标。利用两对BSP引物进行巢式PCR反应,可以特异性得扩增出338bp的DNA片段,含有一个CpG岛共19个CpG位点。各种样品扩增出的片段经过连接克隆载体pMD-19T Vector后进行测序。结果显示,在转基因细胞和克隆胚胎中几乎没有发生甲基化；而在H001和H002的心、肺、肝、腿肌、肾、脑、皮肤、睾丸等组织中,均处于高度甲基化状态,甲基化的位点数占总测序位点数的比值平均达到92.6%。与CMV启动子共同进入宿主细胞的SV40启动子在细胞和胚胎中完全没有甲基化,而在分析的组织中却高度甲基化,比值平均达到79.4%。表达情况与甲基化程度呈负相关,在细胞和胚胎中表达,而在各组织中不表达,这一结论与CMV启动子驱动fat-1基因表达的情况一致。3.CAG启动子驱动的转fat-1基因克隆绵羊的制备及不同水平上的甲基化分析为了与CMV转fat-1基因克隆绵羊进行比较,我们制备了CAG启动子驱动的转fat-1基因克隆绵羊。载体构建在质粒pCMV-fatl的基础上进行,切除CMV启动子连入CAG启动子,最终构建好的载体与原载体相比,除启动子不一样外其余表达元件均相同。获得转基因细胞系后进行体细胞核移植。430枚1-到2-细胞胚胎移植到90只受体羊的输卵管中。50天妊检有8只怀孕,妊娠率为8.9%。大约70天左右时,剖腹取出两只胎儿,命名为N001和N002。用两只胎儿的背部组织制备胎儿成纤维细胞,得到的细胞系生长状态良好。经PCR和RT-PCR检测均为fat-1基因阳性,流式细胞检测绿色荧光细胞所占比例分别为14.90%和8.68%。对两只胎羊的内脏组织,包括心、肺、肝和肾,进行RT-PCR检测显示外源基因fat-1在这些组织中均发生表达。接着,两只CAG克隆羊发育足月并产出,命名为N003和N004。取部分耳组织制备成体成纤维细胞,得到的细胞系生长状态良好,其中N003细胞有绿色荧光发出。经PCR和RT-PCR检测显示N003细胞为fat-1基因阳性。对CAG来源的各种不同样本进行CAG启动子区域的甲基化分析显示,CAG转基因细胞和核移植得到的胚胎几乎没有甲基化,而N001和N002的心、肺、肝、肾以及转基因胎儿来源的成纤维细胞,除了N001和N002的肝脏处于中度甲基化状态(平均为66.2%)外,其余均处于高度甲基化状态,比值平均达到95.3%。这些结果表明CAG启动子受到宿主高度甲基化修饰的调节,-但是没有影响到其启动外源基因fat-1的表达。