湿地松（Pinus elliottii）于20世纪30年代引种至我国,具有适应性强、产脂量高、生长迅速等优良特点,湿地松良种繁育仍然以有性繁殖为主,存在更新慢、成本高、变异大等问题。建立高效的湿地松体细胞发生技术,对实现湿地松高效无性繁殖和加快湿地松良种繁育进度具有重要意义。植物体细胞胚胎发生技术具有繁殖系数高,稳定性强,周期短等优点,成为无性繁殖技术研究中的热点。国内外很多学者都进行过湿地松体细胞胚胎发生技术的研究,且已成功实现湿地松体细胞胚胎发生和植株再生。但湿地松体细胞胚胎发生和植株再生仍存在体胚诱导率低、胚性愈伤组织质量不高、增殖系数低、体胚发育成熟困难、萌发率低等问题,实现湿地松良种的高效繁育技术的商业化应用还需要大量的探索研究。本研究于2018年、2019年连续两年以湿地松未成熟合子胚为材料,采用L9（3~4）正交设计、完全随机区组以及单因素等实验方法,对胚性愈伤组织诱导、增殖、体胚成熟和萌发等不同体胚培养阶段进行研究,并对合子胚和不同表观形态的愈伤组织的形态特征及其内源激素含量差异进行分析,主要研究结果如下:1.胚性愈伤组织的诱导基因型、合子胚发育程度、球果采集日期、植物生长调节剂的种类和浓度配比、碳源、油菜素内酯、硝酸银、抗坏血酸、结冷胶和培养温度等均对湿地松胚性愈伤组织诱导有影响。同一采集日期不同基因型球果合子胚发育阶段不同,同一球果内合子胚发育阶段也不同。2018年采集的16号单株的湿地松的球果于7月4日和7月11日（2-3阶段）胚性愈伤组织诱导率较高,达到33.33%;随着合子胚的成熟,胚性愈伤组织诱导率逐渐降低。湿地松未成熟合子胚处于第2-4阶段时（多胚阶段）,湿地松胚性愈伤组织诱导率最高。在9个激素组合中DCR+5处理:KT 2.2mg/L+2,4-D 2.2 mg/L+6-BA 2.2 mg/L的激素组合的胚性愈伤组织诱导率最高达到30%。湿地松球果采集后在4oC冰箱内保存一个星期,有利于提高胚性愈伤组织诱导率,保存两个月后不利于胚性愈伤组织的诱导。麦芽糖、松三糖相较于蔗糖更有利于胚性愈伤组织诱导,当松三糖浓度为1.5 g/L时,胚性愈伤组织诱导率最高达到40%,平均诱导率最高为20%;当麦芽糖浓度为30 g/L时湿地松胚性愈伤组织诱导率最高达到30%,平均诱导率为18.75%。在23 oC和27 oC培养条件下,湿地松胚性愈伤组织平均诱导率无显著差异,但27 oC条件下,湿地松胚性愈伤组织分化启动更早。固态支撑物结冷胶添加3.0 g/L时胚性愈伤组织诱导率要高于添加6.0 g/L时,最高达42.5%。添加不同浓度油菜素内酯对湿地松体胚诱导率没有显著影响;适量添加抗坏血酸有利于胚性愈伤组织的诱导,当VC浓度为10 g/L时,胚性愈伤组织诱导率最高,达到37.5%;添加硝酸银不利于湿地松胚性愈伤组织的诱导。2.胚性愈伤组织的维持和增殖湿地松胚性愈伤组织增殖培养前期需要3-5天恢复期,后期细胞增殖速度加快。4#胚性细胞系在5处理:DCR+1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA的激素组合中增殖最快,增殖倍数达7.65倍;愈伤组织呈白色透明,有典型丝状结构,且能够长期稳定增殖。添加蔗糖30 g/L的培养基上胚性愈伤组织增殖最明显且增殖倍数最高,达到9.44倍,平均达到6倍。湿地松胚性愈伤组织的固体继代培养以12d为一周期较适宜。湿地松液体悬浮培养初步探究的结果为:以1/4DCR作为基本培养基,添加45g/L蔗糖,并接种2.0 g胚性愈伤组织的悬浮培养条件最优。3.体胚的成熟与萌发探究不同ABA、PEG8000浓度组合对湿地松体胚成熟的影响,试验结果表明在添加10 mg/L ABA+100 g/L PEG 8000的培养条件下能成功诱导出体细胞胚（子叶胚）;不同细胞系体胚成熟的效果差异显著;将成熟培养获得的子叶胚转接至不添加激素的DCR基本培养基上萌发培养,最终萌发获得具有下胚轴伸长,子叶张开,但根部未能发育的早期体细胞胚胚苗。4.湿地松体胚发生的生理生化特性的研究F-A和F-B基因型合子胚发育阶段主要处在早期的第1-4阶段,胚性愈伤组织诱导率较高;F-C和F-D基因型合子胚发育阶段处于晚期,且发育不同步,如7月4日同时观察到第2-3和第5阶段的合子胚,胚性愈伤组织诱导率较低。观察合子胚发育阶段时观察到多胚现象。湿地松未成熟合子胚处于发育早期内源ABA含量较高时有利于胚性愈伤组织的诱导,湿地松未成熟合子胚处于发育后期内源IAA含量较高时不利于胚性愈伤组织的诱导。胚性愈伤组织原胚团由胚头和胚柄细胞组成,原胚团经过原胚团I、原胚团II、原胚团III三个发育时期;非胚性愈伤组织,细胞近球形,通过二分裂的方式增殖。高浓度ABA有利于诱导胚性愈伤组织向体胚分化和成熟。