背景近年来,由非白色念珠菌引发的血流感染呈现逐渐增多趋势,其中,近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）已成为念珠菌血症第二常见病原菌,其致病机制可能与粘附能力及生物膜形成等因素有关。血液是近平滑念珠菌最常见的感染部位,且由近平滑念珠菌导致的念珠菌血症中,多为导管相关性血流感染（Catheterrelated bloodstream infections,CRBSIs）。中国医院侵袭性真菌耐药监测网（CHIFNET）调查结果显示,近平滑念珠菌在血液及导管标本中分离率居首位。与置入血管内导管高度相关的念珠菌血流感染会导致高死亡率和病死率,进而导致医疗费用的增加。因此,对容易引发导管相关血流感染的近平滑念珠菌进行菌株特性的研究,能更好的促进临床制定相关防治策略,从而降低患者的病死率。已有研究发现,近平滑念珠菌感染的发生与中心静脉导管的置入有强烈的相关性。近平滑念珠菌在中心静脉导管上的定植能力与生物膜形成有关,其定植与感染主要取决于对宿主细胞及黏膜上皮的粘附能力。这些研究提示,粘附及生物膜形成可能在近平滑念珠菌引发的血流感染中发挥重要作用,但目前关于近平滑念珠菌生物膜形成的机制并不明确。因此,本研究拟从临床和基础研究方面,探讨近平滑念珠菌血流感染危险因素及相关机制。第一部分ICU近平滑念珠菌血流感染危险因素分析目的分析念珠菌血流感染患者的临床资料,探寻发生近平滑念珠菌血流感染的高危因素,为临床念珠菌血流感染患者的防治提供一定的参考。方法回顾性分析我院重症医学科2013年1月至2019年3月收治的念珠菌血流感染病例的临床资料,将其分为白色念珠菌组,近平滑念珠菌组和其它念珠菌组,对宿主因素、医疗干预行为等相关参数进行单因素分析及回归分析。通过临床资料、实验室血培养和质谱鉴定系统诊断真菌血流感染。宿主因素包括年龄、性别、基础疾病（包括循环系统疾病、肺部疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、肿瘤性疾病等）、入住重症监护病房（Intensive care unit,ICU）的主要原因或疾病、入ICU后24h内急性生理和慢性健康评分（Acute physiology and chronic health evaluation II,APACHE II）、ICU住院天数以及疾病结局。医疗干预行为包括全胃肠外营养（Total parenteral nutrition,TPN）、机械通气（Mechanical ventilation,MV）、特殊药物使用（包括广谱抗生素、激素、免疫抑制剂等;广谱抗生素主要为第四代头孢菌素和碳青霉烯类）、腹部外科手术、中心静脉导管留置部位及时间、血液净化治疗等。分析和探讨发生近平滑念珠菌血流感染的高危因素。结果267例念珠菌血流感染中,白色念珠菌感染63例,非白色念珠菌感染204例。后者包括近平滑念珠菌104例,其它念珠菌100例（热带念珠菌46例,光滑念珠菌22例,季也蒙念珠菌23例,克柔念珠菌5例,葡萄牙及中间念珠菌等4例）。在血流感染念珠菌临床分离株中,以近平滑念珠菌分离株最多。单因素分析显示,APACHE II评分、广谱抗生素使用、中心静脉导管（Central venous catheter,CVC）、中心静脉置管时长＞5天、TPN＞3天以及MV,是发生近平滑念珠菌血流感染的危险因素（p＜0.05）。二元Logistic回归分析显示,中心静脉置管、广谱抗生素使用以及APACHE II评分与发生近平滑念珠菌血流感染密切相关,OR值分别为3.913、2.217和1.159。结论ICU念珠菌血症病原菌中,分离率最高的为近平滑念珠菌,比例超过了白色念珠菌。中心静脉置管、广谱抗生素的使用以及APACHE II评分是发生近平滑念珠菌血症的独立危险因素。第二部分近平滑念珠菌的粘附和生物膜形成能力的研究目的选取从中心静脉导管相关性念珠菌血症患者的血液或导管标本分离的临床菌株进行体外实验,检测并分析近平滑念珠菌与其它念珠菌在粘附能力、生物膜形成总量及代谢活力等方面的差异。同时通过对粘附及生物膜形成能力不同的近平滑菌株进行研究,寻找与近平滑菌株生物膜形成相关的关键因子。方法收集中心静脉导管相关性血流感染（Catheter-related bloodstream infections,CRBSIs）患者血培养或中心静脉导管尖端培养为念珠菌（包括白念、近平滑、热带、季也蒙和光滑念珠菌）的临床分离株27株,菌株复苏后通过全自动质谱仪（MALDI-TOF MS）进行菌种鉴定,对各临床分离株进行体外耐药性检测（Minimal inhibitory concentration,MIC）。根据酵母细胞具有粘附流式细胞分析仪（Fluorescence activated cell sorter,FACS）荧光微球的能力,通过检测粘附相关参数（P2）可以直接反映念珠菌的粘附能力,本实验采用流式细胞术对近平滑念珠菌及其它种类念珠菌临床分离株进行粘附性检测。随后分别采用XTT-甲萘醌直接测定法（OD450nm）和CV-结晶紫间接测定法（OD630nm）检测各临床分离株的生物膜形成能力（包括生物膜的代谢活性及生物膜总量）。此外,根据已有文献报道将近平滑念珠菌转录因子BCR1敲除后其生物膜能力明显减弱,本实验将近平滑念珠菌BCR1实验敲除株（CpΔBCR1）作为对照株,选择生物膜形成能力不同（最强、中等强度）的近平滑念珠菌临床分离株（CP7和CP5）,通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测近平滑念珠菌株粘附相关基因（CpALS6、CpALS7）及生物膜形成相关因子（CpEFG1、CpBCR1）的转录水平。结果从临床CRBSIs患者血或中心静脉导管尖端分离的27株念珠菌MIC结果显示:7株白色念珠菌均为敏感株;4株光滑念珠菌中,1株对氟康唑（FZ）中介,3株对FZ耐药,1株对伏立康唑（VOR）中介,2株对VOR耐药,2株对泊沙康唑（PZ）耐药;6株近平滑念珠菌中,除了1株对FZ耐药,其它菌株对所有抗真菌制剂均敏感;5株热带念珠菌对两性霉素B（AMB）、卡泊芬净（CAS）、米卡芬净（MF）和PZ均敏感,其中4株对VOR耐药;5株季也蒙念珠菌对FZ和VOR均同时耐药。将以上念珠菌临床分离株的粘附能力按流式检测结果（粘附相关参数P2）分为弱（P2:1-20）、中等（P2:21-30）、强（P2:31-50）、非常强（P2:＞50）4个等级。7株白色念珠菌中,5/7（71.4%）粘附力强,2/7（28.6%）粘附力非常强;4株光滑念珠菌中,除1株粘附力中等（Cgl 1）,大部分粘附力弱;近平滑念珠菌中除1株粘附力强（Cpa 5）外,几乎均为粘附力非常强。而热带念珠菌和季也蒙念珠菌检测均显示粘附力非常强。对血流感染念珠菌临床分离株的生物膜形成总量检测表明,近平滑念珠菌生物膜形成总量明显高于其它种类念珠菌。生物膜的代谢活性测定显示,近平滑及季也蒙念珠菌的活性明显高于白念、光滑及热带念珠菌。q RT-PCR检测结果显示:未行药物干预时,与近平滑念珠菌BCR1实验敲除株（CpΔBCR1）相比,粘附相关分子（CpALS6、CpALS7）、生物膜形成相关因子（CpEFG1、CpBCR1）在CP7临床株中的表达均升高;而CpALS7、CpEFG1、CpBCR1在CP5临床株中的表达升高。此外,与CP5临床株相比,CP7临床株中CpALS6和CpBCR1的表达明显增高。结论近平滑念珠菌等非白色念珠菌,其粘附能力明显强于白色念珠菌,且近平滑及季也蒙念珠菌的生物膜形成能力明显强于其它菌株。此外,CpALS7、CpEFG1、CpBCR1等粘附及生物膜形成关键因子可能与近平滑念珠菌导管相关性血流感染有关。第三部分药物干预对近平滑念珠菌粘附和生物膜形成能力的影响目的体外检测米卡芬净、氟康唑及N-乙酰半胱氨酸干预后,对近平滑念珠菌以及其它念珠菌粘附及生物膜形成能力的影响。同时通过对生物膜形成能力不同的近平滑菌株进行研究,检测给予高浓度米卡芬净和N-乙酰半胱氨酸干预后,粘附和生物膜形成相关因子（CpALS6、CpALS7、CpEFG1和CpBCR1）的表达水平。方法分别以不同浓度的氟康唑（Fluconazole,FZ）、米卡芬净（Micafungin,MF）及N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）处理菌株,检测药物干预后各念珠菌临床分离株粘附及生物膜形成能力。此外,通过q RT-PCR检测药物干预后BCR1基因实验敲除株、近平滑念珠菌临床分离株CP7和CP5粘附相关基因（CpALS6、CpALS7）及生物膜形成相关因子（CpEFG1、CpBCR1）的表达情况。结果MF和FZ及高浓度组NAC可降低近平滑念珠菌生物膜产生总量,对于白念组FZ,MF和NAC均可抑制其生物膜形成,在光滑念珠菌组和热带念珠菌组,仅高浓度组MF和NAC可对生物膜产生抑制作用。三种药物均可抑制季也蒙念珠菌生物膜的形成,且高浓度MF和NAC抑制作用更强。仅高浓度MF可降低近平滑等念珠菌的粘附能力。分别使用MF和NAC干预后,CP7临床株中CpALS6、CpALS7、CpEFG1的表达均下降,CP5临床株中CpALS7、CpEFG1的表达下降;CpEFG1在CP7和CP5临床株中的表达下降。而CpBCR1在各菌株中的表达在药物干预前后无明显变化。结论非抗真菌药物NAC对中心静脉导管相关血流感染念珠菌临床分离株生物膜形成具有一定的抑制作用;而MF抑制效果更佳,且抑制作用呈剂量依赖性,且MF可下调CpALS7、CpEFG1等粘附及生物膜形成相关因子表达,成为治疗近平滑念珠菌导管相关血流感染的潜在有效药物。