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目的：
胶质瘤的发病率和死亡率近年来仍呈上升趋势,尤其是胶质母细胞瘤的愈后尤差。虽然手术方法、新辅助化疗方案的有关临床实验取得了一定进展,胶质母细胞瘤的中位生存期仍不足2年。并且做为中枢神经系统的肿瘤,引起的肢体功能障碍及认知功能障碍严重影响生活质量。以IDH1突变为代表的胶质瘤代谢方面的研究重新定义了胶质瘤的分子分类，IDH1突变的胶质瘤患者预后更好，充分说明了代谢途径在胶质瘤发生发展中所起的作用。寻找胶质瘤代谢相关靶点，并据此研制小分子靶向药物具有很好的前景和临床意义。Oridonin在包括胶质瘤的多种癌症中有抑癌作用，并且可以调控AMPK、mTor、RAS、HIF等分子及相应的信号通路，而这些分子均已被证实与能量代谢有着密切的联系。最近的一项研究发现Oridonin通过AMPK调节GLUT1及MCT1表达，继而影响葡萄糖摄入及代谢废物的排出，也说明Oridonin与能量代谢存在密切联系。基于以上的研究结果，我们推测Oridonin可以通过调节细胞能量代谢影响胶质瘤的生长。因此本研究将验证Oridonin在胶质瘤中的作用，探讨其对能量代谢的影响，并筛选Oridonin作用代谢相关的酶，以寻找胶质瘤代谢治疗的靶点，并探索其机制，为寻找更高效的靶向胶质瘤能量代谢的小分子抑制剂提供理论支持。
方法：
1.细胞体外实验检测Oridonin对胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响：
1）通过CCK8梯度浓度测定初步了解Oridonin对胶质瘤细胞的有效浓度范围及IC50，以确定后续实验所用的药物浓度；
2）应用RTCA、集落克隆实验评价梯度浓度Oridonin在体外培养环境下对胶质瘤细胞增殖能力的影响；
3）Annexin及PI双染，流式测定Oridonin在体外培养环境下对胶质瘤细胞凋亡的影响；
4）应用细胞划痕实验及Transwell细胞侵袭实验测定Oridonin对胶质瘤细胞迁移及侵袭能力的影响；
2.建立胶质瘤细胞裸鼠皮下种植瘤模型，观察Oridonin对体内生长环境下胶质瘤细胞的影响；
3.XF96seahorse生物能量分析仪检测梯度浓度Oridonin对胶质瘤细胞氧耗率及胞外酸化率的影响，分析其对有氧糖酵解及线粒体氧化磷酸化的调节作用；
4.高通量转录组测序筛选Oridonin作用后胶质瘤细胞的差异表达基因，得到Oridonin影响代谢相关通路的候选分子（PCK2），并WB验证。
5.搜集TCGA及CGGA数据库PCK2在胶质瘤中的表达情况，并分析其对愈后的影响，评价PCK2在胶质瘤中的临床意义及潜在的研究价值；
6.细胞实验验证PCK2对胶质瘤的作用：
1）构建shPCK2质粒，包被病毒，空白质粒为对照，转染胶质瘤细胞系，构建稳定低表达PCK2的胶质瘤细胞系，WB验证；
2）RTCA、集落克隆实验、流式、细胞划痕实验分别测定敲低PCK2对胶质瘤细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响；
7.XF96seahorse能量代谢分析仪测定敲低PCK2对胶质瘤细胞氧化磷酸化及糖酵解能力的影响；
8.流式检测敲低PCK2及Oridonin对胶质瘤细胞ROS的作用，WB检测PCK2敲低后对凋亡、自噬等指标的影响，探索Oridonin和PCK2作用的分子机制。
结果：
1.细胞体外实验：
1）CCK8实验显示低于4μM的Oridonin对胶质瘤细胞系U251、U87无明显作用，64μM的Oridonin作用下对两种胶质瘤细胞系有明显毒性，对U251、U87的IC50分别为30.02μM、15.55μM；
2）选择5、10、20μM浓度的Oridonin作用于胶质瘤细胞系U251、U87，DMSO做为对照，RTCA实验显示细胞增殖能力下降，集落克隆实验显示集落形成能力下降，Annexin及PI双染显示早期凋亡及晚期凋亡增加，细胞划痕实验显示划痕愈合能力下降，Transwell侵袭实验显示穿过小室的细胞减少，并具有剂量依赖性；
2.体内实验显示Oridonin抑制胶质瘤细胞U87裸鼠皮下移植瘤的生长，而对裸鼠的体重无明显影响；
3.生物能量代谢检测显示Oridonin作用下U251及U87的基础氧耗率、ATP产生氧耗率降低，并且随浓度增高作用明显，20μM时对两种细胞ATP产生耗氧率降低尤其明显，达到50%左右；
4.Oridonin作用下U251及U87的糖酵解产酸率降低，相比较U87糖酵解产酸率降低更明显；
5.全转录组测序显示Oridonin作用下PCK2下降，并得到WB验证。KEGG聚类分析显示柠檬酸循环及丙酮酸代谢通路下调。WB结果显示Oridonin处理组凋亡指标BAX/BCL2升高，自噬指标LC3II升高，mTor信号受到抑制；
6.MERAV、TCGA、CGGA、Gepia和HPA等多个数据库分析显示与正常脑组织比较，PCK2在胶质瘤中高表达，并且在高级别的胶质瘤中表达更高；
7.基于TCGA、CGGA两个数据库的生物信息学分析显示高PCK2表达患者的生存期较短，TCGA数据的COX分析显示PCK2是胶质瘤预后的独立预后因素，高PCK2组的相对风险是低PCK2组的2.088倍，95%CI(1.353-3.222)，P＜0.001。不同IDH1突变状态患者的PCK2表达存在差异，IDH1野生型的患者PCK2表达更高，提示这两种参与葡萄糖代谢的酶可能存在内在联系；
8.敲低PCK2的胶质瘤细胞U251及U87实时细胞活力及细胞划痕愈合能力下降，同时细胞耗氧率及胞外酸化率也较正常对照下降；
9.敲低PCK2及Oridonin作用增加ROS生成，凋亡指标BAX/BCL2升高，自噬指标LC3II升高。
结论：
Oridonin通过影响细胞能量代谢抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并促进其凋亡。我们通过筛查及验证发现糖异生的关键酶PCK2是Oridonin靶点之一。Oridonin对胶质瘤细胞的作用与下调PCK2，继而影响细胞氧化磷酸化及糖酵解能力相关，其作用使细胞产生能量减少，ROS增多，抑制细胞增殖，并诱发细胞凋亡、自噬；PCK2具有成为优质胶质瘤生物学标记的潜力，靶向PCK2或可成为胶质瘤治疗的新策略。
胶质瘤的发病率和死亡率近年来仍呈上升趋势,尤其是胶质母细胞瘤的愈后尤差。虽然手术方法、新辅助化疗方案的有关临床实验取得了一定进展,胶质母细胞瘤的中位生存期仍不足2年。并且做为中枢神经系统的肿瘤,引起的肢体功能障碍及认知功能障碍严重影响生活质量。以IDH1突变为代表的胶质瘤代谢方面的研究重新定义了胶质瘤的分子分类，IDH1突变的胶质瘤患者预后更好，充分说明了代谢途径在胶质瘤发生发展中所起的作用。寻找胶质瘤代谢相关靶点，并据此研制小分子靶向药物具有很好的前景和临床意义。Oridonin在包括胶质瘤的多种癌症中有抑癌作用，并且可以调控AMPK、mTor、RAS、HIF等分子及相应的信号通路，而这些分子均已被证实与能量代谢有着密切的联系。最近的一项研究发现Oridonin通过AMPK调节GLUT1及MCT1表达，继而影响葡萄糖摄入及代谢废物的排出，也说明Oridonin与能量代谢存在密切联系。基于以上的研究结果，我们推测Oridonin可以通过调节细胞能量代谢影响胶质瘤的生长。因此本研究将验证Oridonin在胶质瘤中的作用，探讨其对能量代谢的影响，并筛选Oridonin作用代谢相关的酶，以寻找胶质瘤代谢治疗的靶点，并探索其机制，为寻找更高效的靶向胶质瘤能量代谢的小分子抑制剂提供理论支持。
方法：
1.细胞体外实验检测Oridonin对胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响：
1）通过CCK8梯度浓度测定初步了解Oridonin对胶质瘤细胞的有效浓度范围及IC50，以确定后续实验所用的药物浓度；
2）应用RTCA、集落克隆实验评价梯度浓度Oridonin在体外培养环境下对胶质瘤细胞增殖能力的影响；
3）Annexin及PI双染，流式测定Oridonin在体外培养环境下对胶质瘤细胞凋亡的影响；
4）应用细胞划痕实验及Transwell细胞侵袭实验测定Oridonin对胶质瘤细胞迁移及侵袭能力的影响；
2.建立胶质瘤细胞裸鼠皮下种植瘤模型，观察Oridonin对体内生长环境下胶质瘤细胞的影响；
3.XF96seahorse生物能量分析仪检测梯度浓度Oridonin对胶质瘤细胞氧耗率及胞外酸化率的影响，分析其对有氧糖酵解及线粒体氧化磷酸化的调节作用；
4.高通量转录组测序筛选Oridonin作用后胶质瘤细胞的差异表达基因，得到Oridonin影响代谢相关通路的候选分子（PCK2），并WB验证。
5.搜集TCGA及CGGA数据库PCK2在胶质瘤中的表达情况，并分析其对愈后的影响，评价PCK2在胶质瘤中的临床意义及潜在的研究价值；
6.细胞实验验证PCK2对胶质瘤的作用：
1）构建shPCK2质粒，包被病毒，空白质粒为对照，转染胶质瘤细胞系，构建稳定低表达PCK2的胶质瘤细胞系，WB验证；
2）RTCA、集落克隆实验、流式、细胞划痕实验分别测定敲低PCK2对胶质瘤细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响；
7.XF96seahorse能量代谢分析仪测定敲低PCK2对胶质瘤细胞氧化磷酸化及糖酵解能力的影响；
8.流式检测敲低PCK2及Oridonin对胶质瘤细胞ROS的作用，WB检测PCK2敲低后对凋亡、自噬等指标的影响，探索Oridonin和PCK2作用的分子机制。
结果：
1.细胞体外实验：
1）CCK8实验显示低于4μM的Oridonin对胶质瘤细胞系U251、U87无明显作用，64μM的Oridonin作用下对两种胶质瘤细胞系有明显毒性，对U251、U87的IC50分别为30.02μM、15.55μM；
2）选择5、10、20μM浓度的Oridonin作用于胶质瘤细胞系U251、U87，DMSO做为对照，RTCA实验显示细胞增殖能力下降，集落克隆实验显示集落形成能力下降，Annexin及PI双染显示早期凋亡及晚期凋亡增加，细胞划痕实验显示划痕愈合能力下降，Transwell侵袭实验显示穿过小室的细胞减少，并具有剂量依赖性；
2.体内实验显示Oridonin抑制胶质瘤细胞U87裸鼠皮下移植瘤的生长，而对裸鼠的体重无明显影响；
3.生物能量代谢检测显示Oridonin作用下U251及U87的基础氧耗率、ATP产生氧耗率降低，并且随浓度增高作用明显，20μM时对两种细胞ATP产生耗氧率降低尤其明显，达到50%左右；
4.Oridonin作用下U251及U87的糖酵解产酸率降低，相比较U87糖酵解产酸率降低更明显；
5.全转录组测序显示Oridonin作用下PCK2下降，并得到WB验证。KEGG聚类分析显示柠檬酸循环及丙酮酸代谢通路下调。WB结果显示Oridonin处理组凋亡指标BAX/BCL2升高，自噬指标LC3II升高，mTor信号受到抑制；
6.MERAV、TCGA、CGGA、Gepia和HPA等多个数据库分析显示与正常脑组织比较，PCK2在胶质瘤中高表达，并且在高级别的胶质瘤中表达更高；
7.基于TCGA、CGGA两个数据库的生物信息学分析显示高PCK2表达患者的生存期较短，TCGA数据的COX分析显示PCK2是胶质瘤预后的独立预后因素，高PCK2组的相对风险是低PCK2组的2.088倍，95%CI(1.353-3.222)，P＜0.001。不同IDH1突变状态患者的PCK2表达存在差异，IDH1野生型的患者PCK2表达更高，提示这两种参与葡萄糖代谢的酶可能存在内在联系；
8.敲低PCK2的胶质瘤细胞U251及U87实时细胞活力及细胞划痕愈合能力下降，同时细胞耗氧率及胞外酸化率也较正常对照下降；
9.敲低PCK2及Oridonin作用增加ROS生成，凋亡指标BAX/BCL2升高，自噬指标LC3II升高。
结论：
Oridonin通过影响细胞能量代谢抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并促进其凋亡。我们通过筛查及验证发现糖异生的关键酶PCK2是Oridonin靶点之一。Oridonin对胶质瘤细胞的作用与下调PCK2，继而影响细胞氧化磷酸化及糖酵解能力相关，其作用使细胞产生能量减少，ROS增多，抑制细胞增殖，并诱发细胞凋亡、自噬；PCK2具有成为优质胶质瘤生物学标记的潜力，靶向PCK2或可成为胶质瘤治疗的新策略。