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目的:通过建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）模型,利用10X单细胞RNA测序技术,分析新生大鼠HIBD后松果体组织的细胞亚群及其组成的变化,并在单细胞水平上研究不同细胞亚群的转录组变化,探索新生大鼠HIBD后松果体组织中不同细胞亚群变化的潜在分子机制。方法:1.采用7日龄SD新生大鼠,根据改良Rice-Vannucci法建立HIBD模型,随机分为缺氧缺血组（HIBD组）和假手术组（Sham组）,根据动物的行为改变、脑组织大体形态及TTC染色鉴定HIBD模型;2.应用10X单细胞RNA测序技术,首先从分子水平上明确了新生大鼠HIBD后24h和72h松果体组织中不同细胞亚群及其组成的变化,并在单细胞水平上探索不同细胞亚群的转录组变化,通过统一流形逼近与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection,UMAP）降维可视化算法对细胞簇进行分析,探索HIBD后松果体内沿时间轴发生的分子和细胞事件的动态和形成性图像;3.通过免疫组化和TUNEL法检测HIBD后松果体组织中细胞增殖、凋亡情况;4.RT-qPCR检测与松果体功能直接相关的标志基因芳烷基胺N-乙酰转移酶（Aanat）和乙酰血清素甲基转移酶（Asmt）mRNA表达情况;5.Western blot法检测松果体中程序性细胞死亡（Programmed cell death,PCD）通路的关键分子:NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）及其下游靶基因Gasdermin-D（GSDMD）和半胱天冬酶-1（Caspase-1）等的蛋白表达情况,进一步研究新生大鼠HIBD后松果体组织中不同细胞亚群变化的潜在分子机制。结果:1.单细胞测序结果显示Sham组和HIBD组新生大鼠松果体组织中均存在5种细胞类型:松果体细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、血管和软脑膜细胞以及内皮细胞;根据不同细胞标志物的差异表达情况,松果体细胞进一步分为α和β两种亚型,星形胶质细胞进一步分为α、β和γ三种亚型,小胶质细胞进一步分为α和β两种亚型;2.新生大鼠HIBD后24h和72h松果体组织中内皮细胞比例保持不变;在HIBD后24h和72h,松果体细胞的总比例相对不受影响,而与β-松果体细胞相比,α-松果体细胞比例明显增高;在HIBD后72h观察到γ-星形胶质细胞比例显著增高;在HIBD后24h两种小胶质细胞亚型的比例没有受到影响,而在HIBD后72h,两种亚型的比例均显著降低;3.单细胞测序结果显示,在损伤后24h和72h,Sham组和HIBD组的松果体组织不同细胞亚群中Ki67的表达没有明显差异;免疫组化染色结果显示松果体组织中Ki67的表达在Sham组和HIBD组之间没有显著差异;TUNEL检测显示HIBD后24h和72h松果体切片中凋亡细胞均很少;4.以转录因子Lhx4为标志的松果体细胞是松果体组织的主要细胞成分;不同亚型的总体RNA结果显示,与24h相比,α-松果体细胞和β-松果体细胞的转录组在72h发生了更显著的变化;在新生大鼠HIBD后24h,两种松果体细胞亚型中色氨酸羟化酶1（Tph1）和Asmt均表达上调;RT-qPCR结果显示Asmt的表达在HIBD后24h出现短暂增加,在HIBD后72h显著降低;在HIBD后的两个时间点,Aanat的表达均显著降低;5.三种星形胶质细胞亚型都增加了转录因子Sox9的表达,但它们表现出反应性星形胶质细胞标记物的差异性表达,具体而言,α-星形胶质细胞中波形蛋白在HIBD后24h和72h表达上调,S100a10在HIBD后24h表达上调,在HIBD后72h表达下调;β-星形胶质细胞中波形蛋白和S100a10在HIBD后24h和72h均表达上调;γ-星形胶质细胞中基质金属蛋白酶-2（MMP2）在HIBD后24h和72h表达上调;值得注意的是,胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和补体因子3（C3）这两种常见的反应性星形胶质细胞标记物未通过单细胞测序发现。6.两种小胶质细胞亚型中典型标记物P2ry12和Cx3cr1在损伤后24h表达短暂上调,在72h表达下调。两个时间点均观察到α-小胶质细胞中趋化因子（C-C）配体4和3（Ccl4和Ccl3）的表达上调;β-小胶质细胞中Ccl3表达延迟上调,而Cc14则没有上调。两种小胶质细胞亚型中PCD通路关键分子的表达结果显示Caspase-1表达上调;NLRP3及GSDMD的表达同时激活;Caspase-3和Caspase-7激活程度最低。Western Blot结果显示,在HIBD后24h和72h松果体组织中NLRP3、Caspase-1和GSDMD的表达均显著上调;GSDMD-N显示出随后的上调。TUNEL荧光检测显示Caspase-1与Iba1共定位。结论:1.新生大鼠HIBD后松果体组织中细胞亚群的组成及转录组均发生不同程度变化,提示松果体组织中细胞亚群组成或功能改变在HIBD病理生理中发挥重要作用,可能参与围产期缺氧缺血引起的昼夜节律紊乱的分子机制;2.新生大鼠HIBD后松果体组织中的小胶质细胞发生典型的细胞焦亡,提示小胶质细胞焦亡是松果体组织中细胞亚群变化的重要因素之一,在HIBD引起的松果体损伤中发挥重要作用。