目的:肥胖症人群越来越庞大,非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）患者也在不断增加。NAFLD作为一种多重发病机制的疾病,首要的治疗方法是持续性的降低体重,其它治疗的主要作用方向包括改善细胞代谢,拮抗细胞应激与凋亡,拮抗炎症反应及抗纤维化治疗等。减重手术不仅可以通过降低体重来改善NAFLD,在重塑氧化应激平衡和缓解炎症过程方面也有重要作用。本实验将探索胃袖状切除手术对体重、肝脏脂肪变性情况及肝脏氧化应激状态的影响。研究胃袖状切除手术后胃肠道激素Nesfatin-1水平变化情况及Nesfatin-1通过影响AMPK/Nrf2通路改善氧化应激失衡的作用机制。为进一步发现肝脏抗氧化应激靶点药物及深入了解减重手术作用机制提供实验依据。研究方法:首先选择在中国医大四院普外科进行腹腔镜胃袖状切除手术的肥胖症病人共68例。术前采用超声检测方法均诊断为非酒精性脂肪性肝病。排除标准:糖尿病及糖耐量异常患者,心肺功能不全,手术风险极高的病人,严重的慢性疾病（如严重的自身免疫性疾病或癌症）;酒精摄入量增加（男性酒精消耗量>30g/d,女性酒精消耗量>20g/d）;肝炎或其他慢性肝病;围手术期出现手术并发症的病人;可能影响临床研究的精神障碍,包括痴呆、发作期精神病、严重的抑郁或有企图自杀的历史;患者体内存在异物或植入物,复诊前进行过其它有可能影响检测结果的有创检查等。术后按照饮食指导进行康复,并在术后1年按时回院复查。留取术前与术后1年晨起空腹血液样本,进行Nesfatin-1,血脂,肝功能及血糖等相关指标检查。在动物实验中,选取雄性6周龄C57BL/6J小鼠,采用高脂饲料喂养14周,建立NAFLD小鼠模型。根据设计方案分组:非手术高脂饮食NAFLD小鼠组、假手术摄食量匹配NAFLD小鼠组和胃袖状切除手术NAFLD小鼠组。造模成功后,给予各组对应的干预措施,继续高脂饲养4周后,取材,进行甘油三酯,胆固醇检查,HE染色检查,油红O染色,SOD活力检测,MDA含量检测。Western Blot检测肝脏组织内Nrf2,Nrf2核蛋白,HO-1蛋白,p-AMPKα,AMPKα蛋白水平。细胞实验部分,使用含1 mmol/L游离脂肪酸混合物（FAA）的AML12细胞培养基,诱导AML12细胞,造非酒精性脂肪性肝细胞模型（油酸/棕榈酸=2:1）。给予浓度梯度Nesfatin-1（10-7M、10-9 M、10-11 M）处理细胞,进行细胞TC、TG检测,油红O染色,测量细胞中ROS含量,测量细胞中MDA含量。同时进行SOD、CAT、GSH-Px活性检测,细胞线粒体膜电位检测,Western Blot检测AMPKα、p-AMPKα、Nrf2蛋白、Nrf2核蛋白及下游HO-1蛋白表达水平。明确Nesfatin-1是否通过AMPK/Nrf2调控氧化应激反应。使用siRNA敲低AMPK-α,使用Western Blot和qRT-PCR检测转染效率,给予浓度为10-7 M的Nesfatin-1进行干预,进行细胞TC、TG检测,油红O染色,细胞中ROS检测,细胞中MDA含量检测、SOD、CAT、GSH-Px活性检测,细胞线粒体膜电位检测。Western Blot检测Nrf2蛋白、Nrf2核蛋白及下游HO-1蛋白表达水平。结果:腹腔镜胃袖状切除手术控制体重效果显著。29名患者手术前体重为（124.8±28.77）Kg,SG 后 1 年体重为（83.65±16.34）Kg。手术前 BMI 为（42.63±8.91）Kg/m2,SG 后 1 年体重为（28.54±5.63）Kg/m2。SG 后 1 年 TWL%为（32.11±7.10）%。腹腔镜胃袖状切除手术后1年,患者的肝功能指标ALT,AST与NAFLD的脂肪性变评分情况较前明显改善。ALT,AST水平均较术前明显降低。手术前 ALT 为（124.8±28.77）U/L,SG 后 1 年 ALT 为（29.97±10.33）U/L。手术前 AST 为（79.93±26.41）U/L,SG 后 1 年 AST 为（26.69±9.58）U/L。患者术前HSI为（52.55±9.17）,术后1年时HSI降为（38.84±5.82）。腹腔镜胃袖状切除手术后1年,患者术前Nesfatin-1值为（3.04±0.81）ng/ml,术后1年时Nesfatin-1值为（5.52±1.55）ng/ml。手术后Nesfatin-1升高百分比与手术后HSI降低百分比为正相关（P<0.05;r=0.44;）。腹腔镜胃袖状切除手术后1年,患者血糖与甘油三酯情况较前改善。手术前患者空腹血糖为（5.8±0.8）mmol/L,SG后1年空腹血糖为（4.9±0.3）mmol/L。手术前甘油三酯为（2.0±0.6）mmol/L,SG后1年甘油三酯为（1.3±0.4）mmol/L。动物实验部分,非手术高脂饮食组随着时间延长,体重出现持续性上升趋势。假手术摄食量匹配组术前体重（39.3±3.61）g,手术后1周体重轻度下降（38.5±3.21）g,随后体重逐渐稳定,没有大幅度上升,出现轻度波动。胃袖状切除手术组术前体重（38.1±1.34）g,手术后1周,体重快速下降（32.7±1.25）g,之后出现小幅度波动,手术后4周有反弹趋势。HE染色和油红O染色检查显示在光镜下进行观察:非手术高脂饮食组小鼠的肝小叶正常结构消失,肝细胞内大量脂滴出现。胃袖状切除手术组小鼠的肝小叶结构基本正常,肝细胞无明显脂滴浸润,无变性。胃袖状切除手术组TC（3.05±0.07）mmol/L,非手术高脂饮食组TC（6.24±0.11）mmol/L,假手术摄食量匹配组 TC（4.95±0.08）mmol/L。胃袖状切除手术组TG（1.64±0.04）mmol/L,非手术高脂饮食组TG（3.1±0.05）mmol/L,假手术摄食量匹配组TG（2.38±0.05）mmol/L。以上结果显示,SG显著降低了小鼠血清中TC、TG的水平（P<0.05）。胃袖状切除手术组SOD（106.01±1.54）U/mgprot,非手术高脂饮食组SOD（55.35±1.09）U/mgprot,假手术摄食量匹配组 SOD（78.05±1.16）U/mgprot。胃袖状切除手术组 MDA（4.324±0.203）nmol/mgprot,非手术高脂饮食组 MDA（7.915±0.234）nmol/mggprot,假手术摄食量匹配组MDA（6-255±0-146）nmol/mgprot。以上结果显示,SG降低了小鼠肝脏组织中MDA含量,提升了 SOD活力（P<0-05）。Western blot检测发现肝脏组织内Nrf2蛋白在各组之间均无明显差异。Nrf2核蛋白、HO-1蛋白及p-AMPKα蛋白在胃袖状切除手术组表达量高于非手术高脂饮食组和假手术摄食量匹配组,差异有统计学意义（P<0-05）。细胞实验方面,FFA诱导后,肝细胞出现明显脂滴沉积。对细胞进行TC、TG 检测及油红 O 染色,模型组 TC（6.33±0.32）mmol/L 和 TG（4.21±0.28）mmol/L显著高于对照组 TC（1.62±0.49）mmol/L 和 TG（0.97±0.19）mmol/L。与模型对照组相比,当细胞培养基内加入的Nesfatin-1浓度分别为10-11 M,10-9 M,10-7M时,FFA诱导的AML12细胞产生的活性氧水平依次降低。当Nesfatin-1浓度由10-11M升至10-7 M时,MDA含量检测逐渐下降,与模型对照组相比,MDA含量由（5.52±0.26）nmol/mgprot,降至（2.82±0.14）nmol/mgprot。SOD、CAT、GSH-Px活性检测结果发现,与模型对照组相比,当细胞培养基内加入的Nesfatin-1 浓度分别为 10-11 M,10-9 M,10-7M 时,FFA 诱导的 AML12 细胞中SOD、CAT、GSH-Px 活性依次上升,SOD 由（26.84±0.42）U/mgprot,升至（46.84±0.34）U/mgprot,CAT由（7.92±0.57）U/mgprot,升至（12.92±0.42）U/mgprot,GSH-Px 由（17.23±0.62）U/mgprot,升至（27.66±1.09）U/mgprot,差异有统计学意义（P<0.05）。Nesfatin-1可以减少高脂诱导细胞导致的线粒体膜电位丧失,当Nesfatin-1浓度为10-7 M时,LR比例为（9.14±0.89）%,当Nesfatin-1浓度为 10-9M 时,LR 比例为（10.95±0.85）%,当 Nesfatin-1 浓度为 10-11M 时,LR比例为（12.94±0.78）%,但中剂量Nesfatin-1与高剂量Nesfatin-1对线粒体膜电位丧失影响之间无显著差异。Western blot检测发现Nrf2蛋白的表达在各组之间均无明显差异。通过对p-AMPKα,AMPKα、Nrf2核蛋白、HO-1进行检测,发现Nesfatin-1以浓度依赖的方式激活AMPK并上调核内Nrf2蛋白及下游HO-1蛋白水平,结果与对照组有统计学意义（P<0.05）。将Nesfatin-1干预浓度固定为10-7 M,分别加入由FAA诱导的AML12细胞、阴性转染后细胞和AMPKα1 siRNA转染后细胞检测ROS合成情况,发现敲低AMPKα1后Nesfatin-1抑制活性氧生成的作用受到一定抑制,表明AMPK是Nesfatin-1发挥抗氧化应激作用的途径之一。进一步检测,当阻断AMPKα1后,细胞内MDA含量变化,SOD、CAT、GSH-Px的活力水平变化情况。Nesfatin-1干预阴性转染模型组的MDA含量最低（2.72±0.33）nmol/mgprot,AMPKα1敲低后,细胞MDA含量上升为（4.61±0.26）nmol/mgprot,但仍低于未加入 Nesfatin-1 的 AMPKα1 siRNA 转染组（7.51±0.22）nmol/mgprot,P<0.05。这一结果说明 AMPK 参与了 Nesfatin-1对氧化应激平衡的调节,但不是唯一作用机制。SOD、CAT、GSH-Px的活力检测同样反映出这一结果,Nesfatin-1干预阴性转染模型组时SOD为（45.86±0.91）U/mgprot,CAT为（12.53±0.58）U/mgprot,GSH-Px 为（27.39±0.83）U/mgprot,当 AMPKα1 敲低后,SOD 降为（30.89±0.38）U/mgprot,CAT 降为（8.82±0.32）U/mgprot,GSH-Px 降为（20.50±0.92）U/mgprot,差异均有统计学意义P<0.05。Nesfatin-1干预阴性转染模型组的LR比例为（8.24±0.59）%,AMPKα1敲低后,LR比例升至为（17.11±1.73）%。使用浓度为10-7M的Nesfatin-1干预细胞,并敲低AMPKα1,通过Western blot检测Nrf2,Nrf2核蛋白,HO-1蛋白水平。经AMPKαt1敲低后,伴有核内Nrf2蛋白水平及下游HO-1蛋白的下调（P<0.05）。结论:胃袖状切除术可有效缓解NAFLD,降低肥胖患者体重,改善血糖,血脂等代谢相关指标。胃袖状切除术后Nesfatin-1升高变化与HSI降低变化呈正相关关系。胃袖状切除手术和摄食量限制可以降低NAFLD小鼠体重。胃袖状切除手术可以有效降低NAFLD小鼠血脂水平,缓解肝脏脂肪变性,激活AMPK/Nrf2通路,降低NAFLD小鼠肝脏氧化应激水平。Nesfatin-1可以浓度依赖性的改善非酒精性脂肪肝细胞氧化应激状态,通过激活AMPK/Nr2信号通路减轻高脂诱导的肝细胞氧化应激损伤。