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目的:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是脊柱损伤最严重的并发症,是一种严重的神经系统功能障碍疾病。研究表明人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSCs)用于SCI大鼠治疗,可改善其运动功能,促进神经生长因子表达,抑制IL-1β分泌。小剂量超短波(ultrashort wave,USW)作为一种物理疗法,在各种急性炎症的治疗中均获得良好成效,能够辅助发挥抑制炎症,消除水肿,改善血液循环,促进神经再生等功能。在炎症疾病中,MAPK激活蛋白酶2(MAPK-activated protein kinase 2,MK2)能够使锌指蛋白家族成员之一的RNA结合蛋白Tristetraprolin(TTP)活化,从而调控TNF-α及炎性因子翻译,促进TNF-α及炎性因子的表达。本研究拟利用USW对炎性微环境的改善作用,联合HUC-MSCs治疗SCI,观察其治疗效果以及对炎性微环境的影响,探讨联合治疗法对MK2/TTP信号通路与NLRP3的调控机制,为改进HUC-MSCs治疗方法及实现干细胞临床治疗应用提供新的科学依据和理论基础。方法:利用Allen’s打击法建立SD大鼠脊髓损伤模型,设立5组,分别为(1)假手术组(Sham):该组大鼠只进行背部手术不做脊髓打击;(2)脊髓损伤组(SCI):经过打击造成脊髓损伤后,不做其他处理;(3)USW治疗组(USW):脊髓损伤大鼠用小剂量超短波进行治疗;(4)HUC-MSCs治疗组(HUC-MSCs):脊髓损伤大鼠背部注射HUC-MSCs细胞进行处理;(5)USW联合HUC-MSCs治疗组(USW+HUC-MSCs):大鼠脊髓损伤模型先注射HUC-MSCs,再进行小剂量超短波处理。对各组大鼠进行Basso Beatlie&Bresnahan(BBB)行为学评分,利用HE染色对各组大鼠脊髓组织进行病理学观察,用尼氏染色观察神经细胞活性,用免疫荧光实验检测各组大鼠脊髓神经元损伤情况,TUNEL法检测神经元凋亡,用ELISA方法检测各组大鼠脊髓组织中的炎性相关因子M-CSF、IL-6、IL-10及IL-1β、IL-18、TNF-α的表达情况。用Western-blot法检测MK2、p-MK2、TTP、NLRP3以及其相关蛋白pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-casepase-1的表达变化,用免疫荧光双标法检测脊髓小胶质细胞的极化标志物i NOS和Arg-1,并观察小胶质细胞中MK2、NLRP3的表达情况。同时建立MK2过表达小胶质细胞损伤模型,将小胶质细胞分为6组:(1)Control组:正常培养的小胶质细胞,不做任何处理;(2)LPS组:LPS处理小胶质细胞后,继续常规培养;(3)USW组:LPS处理后的小胶质细胞,用USW干预并继续培养;(4)HUC-MSCs组:LPS处理后的小胶质细胞,加入HUC-MSCs细胞共培养;(5)USW+HUC-MSCs组:经过LPS处理的小胶质细胞,在USW干预后,加入HUC-MSCs细胞继续培养;(6)OV-MK2:MK2过表达细胞系经过LPS处理后,先用USW进行干预,再加入HUC-MSCs细胞进行共培养。用Western-blot方法检测各组细胞中TTP、NLRP3、i NOS、Arg-1、pro-IL-18、pro-IL-1β等蛋白的表达水平变化,ELISA法检测各组细胞上清液中IL-6、IL-10、IL-1β、IL-18等炎性因子的变化。结果:脊髓损伤后第1天,大鼠完全丧失后肢运动功能,为软瘫状态,BBB评分均为0分,术后2~4周评分逐渐恢复,4w时USW组和USW+MSCs组BBB评分均明显好于SCI组(P<0.05),而MSCs组与SCI相比无明显差异(P>0.05),说明SCI术后4w内,USW联合MSCs治疗对改善大鼠运动功能中以USW作用为主。病理组织学显示,脊髓损伤时脊髓背侧可见坏死的组织和细胞碎片,炎性细胞浸润明显,免疫荧光检测Neu N,显示损伤头端神经元数量下降,而USW组、MSCs组和USW+MSCs组对脊髓损伤均有改善作用,炎性细胞浸润程度均降低,损伤头端神经元数量显著大于SCI组(P<0.05)。可见在改善大鼠行为学功能上,是以USW的作用为主,MSCs起辅助作用,二者联合可以改善SCI大鼠脊髓损伤,其治疗机制提示与改善血液循环、增强组织营养、减轻炎症水肿有关。SCI的发生会引起小胶质细胞活化和巨噬细胞的浸润,形成局部炎性微环境。SCI发生后,小胶质细胞从静息状态最终极化为M1、M2型,本研究用IBA-1标记小胶质细胞,免疫荧光双标观察M1型标志因子i NOS及M2型标记因子Arg-1表达,建模2周后,处于静息状态(M0)的小胶质细胞被极化为M1、M2型,i NOS和Arg-1表达均显著升高,且过度活化的M1型小胶质细胞分泌大量的炎性因子,IL-6含量显著升高;USW组、MSCs组和USW+MSCs组M2型小胶质细胞逐渐占据优势,Arg-1表达升高,M-CSF和IL-10含量升高,而i NOS表达降低,IL-6含量下降,其中USW+MSCs组炎症因子下降最为显著,而USW组和MSCs组之间未见显著差异,提示USW与MSCs联合应用可以为神经元提供较为适宜的微环境。炎症反应的启动需要炎症小体(inflammasome)的蛋白复合体参与。已证实脊髓损伤后NLRP3炎症小体的表达水平显著上调,抑制NLRP3炎症小体能够改善SCI后的运动功能。本研究通过免疫荧光双标观察小胶质细胞中炎症小体的表达,结果SCI组脊髓小胶质细胞标记物IBA-1和NLRP3表达同时升高,随后NLRP3催化pro-caspase-l表达上调,进而促进pro-IL-lβ和pro-IL-18表达,同时将其转变为具有生物活性的IL-lβ和IL-18,参与后续的炎症反应,导致脊髓中的神经元细胞凋亡。USW组、MSCs组和USW+MSCs组均表现出不同程度抑制NLRP3的作用,其中单独应用MSCs对免疫微环境的改善作用较弱,而USW与MSCs联合应用效果显著,表现出抑制pro-caspase-l、pro-IL-lβ和pro-IL-18的作用,同时减少了IL-lβ和IL-18的释放,降低脊髓神经元细胞凋亡,提示USW与MSCs联合应用可以抑制炎症小体,减轻脊髓神经元损伤。我们的前期结果显示MK2在SCI患者血清中表达高于非SCI患者,MK2基因表达上调,这可能和局部炎性微环境的产生有关。本实验探究了HUC-MSCs联合USW对SCI大鼠MK2的作用,结果SCI大鼠可促使MK2磷酸化,抑制TTP活性,进而促进下游因子TNF-α的释放,有趣的是,在小胶质细胞中我们同样发现MK2的表达升高,提示MK2参与了SCI大鼠炎症微环境的形成。USW组、MSCs组和USW+MSCs组均表现出不同程度抑制MK2的作用,其中USW与MSCs联合应用效果显著,MK2磷酸化水平受到抑制,TTP表达上调,TNF-α含量降低。推测SCI发生时,MK2表达上调,抑制TTP活性,同时促进NLRP3表达,增加炎性因子分泌,从而促进局部炎性微环境的形成。为探讨MK2/TTP通路与NLRP3在HUC-MSCs联合USW减轻SCI大鼠脊髓损伤的作用机制,选用大鼠脊髓小胶质细胞,使用LPS诱导构建脊髓损伤细胞模型,分别使用USW、与HUC-MSCs共培养、以及USW联合HUC-MSCs共培养对细胞进行干预,结果USW联合HUC-MSCs可调控小胶质细胞极化状态,抑制小胶质细胞向M1型极化,促进其向有修复再生作用的M2型极化,同时IL-6含量降低,IL-10含量升高;当在细胞水平上调MK2表达时,USW联合HUC-MSCs对小胶质细胞的极化调控被破坏,M1型占据主导,炎症因子含量升高;同时过表达的MK2解除TTP对NLRP3表达的抑制,增加NLRP3、pro-IL-lβ和pro-IL-18的表达。提示HUC-MSCs联合USW可通过抑制MK2磷酸化下调NLRP3表达,减轻炎症反应,改善炎症微环境,缓解脊髓损伤。结论:1、超短波联合人脐带间充质干细胞具有修复神经细胞和减少炎性因子的作用,能够有效减轻脊髓损伤。2、超短波联合人脐带间充质干细胞可以抑制NLRP3炎性小体的分泌,调节小神经胶质细胞的极化。3、超短波联合人脐带间充质干细胞通过MK2/TTP/NLRP3信号通路,改善炎症微环境,缓解脊髓损伤。