论文部分内容阅读
本研究筛选乳脂率具有极端差异的荷斯坦奶牛,并从新鲜牛奶中分离培养原代奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）。利用转录组结合加权基因共表达网络分析（WGCNA）深入挖掘调控奶牛乳脂代谢的关键候选基因及lncRNAs,并构建内源竞争RNAs（ceRNAs）调控网络。之后在细胞水平上对可能调控奶牛乳脂合成的关键候选基因进行功能验证。反10顺12共轭亚油酸（t10,c12-CLA）对反刍家畜乳脂合成的抑制作用在细胞和营养水平均有大量的实验数据支持,但不同学者发现其对脂肪酸转位酶（CD36）和长链脂肪酸辅酶A连接酶1（ACSL1）的调控方式不同。本研究将在细胞水平深入解析t10,c12-CLA对乳脂代谢的调控作用,并探索关键候选基因对t10,c12-CLA的乳脂抑制作用是否产生影响,这对调节牛奶中脂肪酸成分和含量、提高牛奶品质具有重要的理论意义和实用价值,为理解奶牛乳脂合成过程中的复杂生物学提供理论依据。本研究主要结果如下:1.转录组结合WGCNA鉴定奶牛乳脂代谢关键lncRNAs和mRNA选择8头体细胞数在10万/mL以内且乳脂率具有极端差异的荷斯坦奶牛,无菌采集新鲜乳液并成功分离、鉴定出BMECs。反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和甘油三脂（TAG）试剂盒检测结果表明,高乳脂组BMECs中乳脂代谢相关标志基因的表达及TAG含量明显高于低乳脂组,与乳脂率表型及乳脂层差异完全一致。通过高、低乳脂率BMECs转录组测序共鉴定出38个差异表达lncRNAs（DELs,padj＜0.05）,包括18个乳脂代谢候选DELs。其中TCONS00082721为共位置和共表达共同预测到的可能调控乳脂代谢的DELs,其与FABP4基因的靶向关系需重点关注。此外,我们构建了 156个乳脂代谢相关ceRNAs互作调控网络,以miR-145为中心的调控网络将是后续实验研究的焦点。利用WGCNA对lncRNAs表达谱数据进行综合分析,发现24个corelncRNAs与脂代谢密切相关。根据内源竞争机制我们构建了 22个最有可能参与乳脂代谢的ceRNAs,TCONS00133813和bta-miR-2454-5p分别位于该网络的核心位置。此外,利用转录组测序共鉴定出47个差异基因（DEGs,padj＜0.05）。通过功能富集分析最终筛选出11个可能调控乳脂代谢的候选DEGs,分别为PDGFD、BCAT1、APOL3、ATP8A2、PTPRR、KCNMA1、ZFYVE28、ENPP2、DKK1、CES4A和 CTSH。利用WGCNA对mRNA表达谱数据进行综合分析,共筛选出5个乳脂代谢相关候选DEGs,分别为PI4K2A、SLC16A1、ATP8A2、VEGFD和ID1,其中ATP8A2为转录组和WGCNA共同筛选得到的候选DEGs。2.乳脂代谢关键候选基因的鉴定及功能分析对转录组及WGCNA分析得到的15个乳脂代谢候选DEGs进行组织表达谱分析,发现ENPP2、PI4K2A、TCSH和PTPRR基因在乳腺组织中的表达水平均高于其它组织。相对于其它基因,PI4K2A和CTSH在乳腺组织和BMECs中的表达都处于较高水平。研究确定PI4K2A为调控奶牛乳脂合成的关键候选基因,核质分离实验结果表明其主要在细胞质中表达。PI4K2A基因CDS区全长1440 bp,编码479个氨基酸。蛋白功能预测发现PI4K2A为非分泌型且不稳定的亲水蛋白,磷酸化位点较多,翻译后的修饰作用非常丰富。PI4K2A蛋白的二级和三级结构均以无规则卷曲为主,α-螺旋次之。3.PI4K2A基因对奶牛乳脂合成和BMECs增殖、凋亡的影响过表达和干扰实验结果表明,PI4K2A基因对奶牛乳脂合成中脂肪酸转运过程具有正向调控作用,可间接调控脂肪酸从头合成、长链脂肪酸（LCFA）摄取和脂肪酸（FA）去饱和。通过检测BMECs中TAG、总胆固醇含量和脂滴分泌情况,发现PI4K2A基因对奶牛乳脂合成同样具有正调控作用。此外,干扰PI4K2A对乳脂的抑制作用可能强于过表达PI4K2A对乳脂合成的促进作用,侧面反映PI4K2A基因可能是奶牛乳脂合成过程所依赖的重要调控因子。EdU和凋亡试剂盒检测结果表明,过表达PI4K2A基因促进BMECs的增殖,抑制其凋亡;相反,干扰PI4K2A基因抑制BMECs的增殖,促进其凋亡。4.PI4K2A介导t10,c12-CLA在奶牛乳脂抑制中的调节作用对体外培养的BMECs外源添加浓度为170 μM的t10,c12-CLA后能够显著抑制FA从头合成、LCFA摄取、转运与去饱和及TAG合成和脂滴分泌过程,这种抑制作用可能与PPARs、ELOVL6和EGFR基因的下调存在潜在且重要的联系。过表达PI4K2A能够减弱t10,c12-CLA对乳脂的抑制作用,敲低PI4K2A对t10,c12-CLA的乳脂抑制作用无显著影响,提示t10,c12-CLA抑制奶牛乳脂合成过程可能不依赖于PI4K2A。综上所述,本研究通过BMECs转录组学和WGCNA鉴定出15个乳脂代谢相关的候选DEGs及18个DELs,结合qRT-PCR技术最终确定PI4K2A为调控乳脂代谢的关键候选基因。PI4K2A基因可正向调控奶牛乳脂合成和BMECs增殖,负调控BMECs的凋亡。PI4K2A基因过表达能够减弱t10,c12-CLA对乳脂的抑制作用。本研究结果为解析乳脂性状调控机制提供了基础,为奶牛乳成分性状精准分子育种提供了遗传标记信息。