蛋白质组学研究旨在从分子层面揭示生命现象和规律,已成为21世纪生命科学与生物技术的重要战略前沿和主要突破口。当前,蛋白质组学发展面临两个重要挑战分别是如何突破传统方法无法兼容现代仪器的技术瓶颈,以及如何利用前沿技术开发提高重要生物样本蛋白质鉴定深度和定量准确度的方法。基于上述难题,本课题重点开展了两部分研究工作,分别是平行通道多维蛋白质鉴定技术（parallel channel multidimensional protein identification technique,PC-MudPIT）的开发和数据非依赖采集（data independent acquisition,DIA）技术在尿液蛋白组学中的定量研究。20年前美国斯克里普斯（Scripps Research Institute）的John Yates教授开发了多维蛋白质鉴定技术（multidimensional protein identification technology,MudPIT,本文中称为“经典MudPIT”）,实现了溶液样品直接线上自动化分级和分析,在高度复杂样品的蛋白质组深度鉴定方面展现了无可比拟的优势。然而,Yates教授的经典MudPIT在强阳离子交换（strong cation exchange,SCX）的肽段洗脱过程中,会将不同浓度的盐引入质谱仪中,近年来质谱仪器随着灵敏度的不断升级,对盐离子的耐受性越来越低。因此,与现代质谱仪无法兼容成为了限制经典MudPIT被持续应用的主要瓶颈因素。虽然,研究者可以通过引入各种形式的捕集柱（trap柱）管路进行改良,但是死体积会显著增加,反相分离维度的连续性被破坏,使得色谱分辨率和灵敏度降低,从而导致这些改良技术没有得到广泛使用和推广。目前蛋白质组多维分离技术又回到了原始的离线操作模式。因此,突破传统方法解决经典MudPIT无法兼容现代仪器的技术瓶颈至关重要。针对上述问题,我们开展了第一部分研究工作—PC-MudPIT技术的开发。我们设计了两个色谱通道,平行交替执行一维分馏、脱盐和二维分离的功能,最终实现不需要增加trap柱管路,就能够在分析柱上直接脱盐的目的。同时两通道平行工作将系统中最昂贵的部分质谱分析的空闲时间缩短为最小,并使得自动化线上磷酸化蛋白质分析成为可能。近年来,DIA技术逐渐开始应用于蛋白质组学的前沿研究,其优势在于离子的碎片化独立于前体离子的组成,具有高覆盖度、高重复性和高准确性的特点。但迄今为止,DIA技术在复杂基质样本中的应用仍然存在诸多挑战,特别是其对尿液样本的鉴定深度仅停留在每个样品1000-2000个蛋白质的水平,导致尿液作为可通过无创方式获得的重要临床样本,却无法成为临床疾病研究的理想材料。因此,利用前沿技术提高重要生物样本（如尿液）蛋白质鉴定深度和定量准确度尤为重要。在第二部分研究中,我们首次基于新型质谱仪timsTOF pro（布鲁克,德国,不来梅）,通过优化LC-MS的关键参数,开发了专门针对尿液蛋白质组的全套DIA新方法,将尿液蛋白质组的平均鉴定深度从每个样品不到2000提高到了 4000个蛋白质的水平,突破式地解决了尿液蛋白质组覆盖深度低的问题。将该方法应用于新冠肺炎病人尿液蛋白质组研究,揭示了新冠肺炎感染早期患者主要表现为免疫抑制和紧密连接受损,发病机制或存在“两阶段”模式。