组蛋白是细胞核最重要的结构蛋白,它与DNA结合形成核小体,作为染色体和染色质最基本的结构。组蛋白与DNA形成核小体后,其N末端伸出核小体外,上面的一些氨基酸被共价修饰,包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化以及ADP-核糖基化等,它们调控如DNA复制、转录(基因表达)、遗传重组、细胞分裂等一系列生物学过程。事实表明这些生物学反应是由不同的组蛋白共价修饰在时间和空间联合介导的,因此这些组蛋白尾部的翻译后修饰功能,被称为“组蛋白密码”。 在细胞有丝分裂过程中都能发现组蛋白H3尾部(氨基末端)的磷酸化作用。为了研究组蛋白的氨基末端磷酸化过程与有丝分裂的关系,在本学位论文研究中,利用二个细胞系：人乳腺癌细胞MCF-7和人脐静脉内皮细胞ECV 304,使用了同步化技术、SDS PAGE、Western blotting,免疫荧光标记技术和激光共聚焦显微镜技术,研究组蛋白H3磷酸化过程与细胞有丝分裂各相期的关系。观察Ser10磷酸化H3,Ser28磷酸化H3,以及Ser7磷酸化CENP-A蛋白在细胞内的动态分布,以分析组蛋白磷酸化的生物学功能。 研究结果表明,组蛋白H3在有丝分裂过程中,两个丝氨酸残基Ser10和Ser28发生了磷酸化作用。Ser10磷酸化组蛋白H3首先出现在G2晚期的核周缘,Ser28磷酸化组蛋白H3紧随其后出现,两个位点的磷酸化在中期到达高峰,并扩展到染色体的所有部分。当细胞有丝分裂进入后期和末期,组蛋白H3 Ser28的磷酸化逐渐消退,而组蛋白H3 Ser10磷酸化的荧光信号也逐渐从染色体上消失,此时在纺锤体中央部位出现Ser10磷酸化H3。研究结果表明,组蛋白H3 Ser10和Ser28的磷酸化与细胞有丝分裂染色体的凝集和解凝集过程有着时间和空间上的相关性。Ser10和Ser28这两个位点发生磷酸化作用,可使组蛋白H3氨基末端的正电荷数降低,改变了组蛋白-DNA间的相互作用,这可能是导致染色质变构凝集的原因之一。 我们比较有丝分裂细胞中Ser10磷酸化的H3和Ser7磷酸化的CENP-A的动态分布,发现这两个蛋白磷酸化信号的模式不同：我们发现CENP-A的磷酸化在晚前期,中期的p-CNEP-A信号出现在赤道板附近的核小体上,但是到了末期,转移到中体上。CNEP-A的磷酸化修饰与H3有些共同点,但是在时间上却不相同。我们结果表明,CENP-A与H3行使的功能相似,只是结合在不同的位置的DNA上。根据激光共聚焦显微分析表明,随着卵裂沟在末期的收缩,中体区域被压缩成联系两个子代细胞的“桥状”复合物。其中压缩的微管构成中体复合物的“两臂”,中间有一个由Ser10磷酸化H3,CENP-A,Aurora B等蛋白参与的结构特殊的蛋白质复合物连接,参与两个子代细胞的分离。这些事实表明,Ser10磷酸化H3以组成“中体”的形式参与胞质分裂。这些实验结果还提示大部分细胞的核分裂与胞质分裂是个连续过程。 对不同的细胞来说,有丝分裂所需的时间也不尽相同。本研究利用显微镜实时摄像的方法,发现大部分体外培养的哺乳动物细胞有丝分裂的时间约1小时,其中,前期中期持续的时间较长,差别也比较大；后期的时间很短,并且不同的细胞差别不大。因此可见,染色体的前期凝集、和中期排列对分离非常重要,所以在纺锤丝的牵引下染色体在赤道板上不停的翻转以达到一个可靠的最适合分离的排列方式。胞质分裂中卵裂环以及之后的中体形成也很快,但是两个细胞在中体处的切割却久久没能完成。两个细胞在中体的一侧切割,不对称分离,中体黏附于一个子细胞,并在相当长的时间内中体都没有与之分离。