【摘 要】
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谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum（C.glutamicum）是一种从土壤中分离得到的具有高GC含量的革兰氏阳性菌。它是工业生产氨基酸的重要菌株,已广泛应用于医药、食品及饲料等行业。谷氨酸棒状杆菌的全基因组测序已经完成,为该菌的改良提供了切实可靠的基础。国外已有研究证明,敲除部分前噬菌体基因和限制性酶修饰系统的棒状杆菌能有效地表达外源蛋白,但该菌种尚未商业化。本研究
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谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum（C.glutamicum）是一种从土壤中分离得到的具有高GC含量的革兰氏阳性菌。它是工业生产氨基酸的重要菌株,已广泛应用于医药、食品及饲料等行业。谷氨酸棒状杆菌的全基因组测序已经完成,为该菌的改良提供了切实可靠的基础。国外已有研究证明,敲除部分前噬菌体基因和限制性酶修饰系统的棒状杆菌能有效地表达外源蛋白,但该菌种尚未商业化。本研究以p K19mobsac B自杀质粒为基础载体,采用DNA同源重组方法,通过Sac B介导的自杀式筛选将ATCC13032菌株基因组中的部分前噬菌体基因Aa:1,399,937-1,412,921（12,985bp）,Bb:1,636,872-1,641,038（4167bp）,和Cc:1,776,553-1,995,764（219,212bp）和内切酶系统基因Dd:1,878,335-1,882,387（4053bp）敲除,成功获得了一株ATCC13032-ΔDd Aa Cc Bb改良菌种,生长曲线测定显示ATCC13032-ΔDd Aa Cc Bb缺失株生长未受影响。为评价该改良菌种是否有更高的表达外源蛋白的能力,我们以p XMJ19质粒为载体用绿色荧光蛋白（GFP）为模式蛋白,比较了该改良菌ATCC13032-ΔDd Aa Cc Bb和野生菌ATCC13032表达GFP的能力。结果显示改良菌不仅具有更高的转化效率,表达GFP蛋白的水平也明显增强。外源蛋白通过N端与信号肽C0949融合后表达的分泌型蛋白直接可从细胞培养液中获得。通过比较不同来源的启动子,实验结果显示出启动子J23100比人工合成启动子PH36有更强的驱动GFP表达的能力,同时用J23100启动子不需任何诱导剂诱导就能持续表达,其表达的蛋白能较好地维持原有的空间结构,从而具良好的生物学活性。高拷贝的质粒载体可以更好地应用于DNA或蛋白质的合成。目前还没有任何拷贝数高的棒状杆菌商业化质粒上市。为此我们对棒状杆菌/大肠杆菌穿梭载体p XMJ19质粒的棒状杆菌复制子区域进行定点突变,成功获得3株复制能力提高5～10倍的高拷贝质粒,p XMJ19-C1786A、p XMJ19-C1786G和p XMJ19-C1786T,并经过连续传代证明这些突变不影响质粒的稳定性,这为DNA和蛋白疫苗的研发提供了基础。综上所述,本研究成功构建了一个无内毒素污染的异源蛋白表达平台,获得了一株ATCC13032-ΔDd Aa Cc Bb改良菌种,这将利于未来抗原和酶等功能蛋白表达的革新与应用。N端与分泌信号肽融合的目的蛋白能分泌到细胞外,直接释放到培养基中,通过简单处理便可回收并纯化目的蛋白。这对以谷氨酸棒状杆菌作为宿主表达外源蛋白具有重要指导意义,此外也为日后构建基因工程菌、构建高效生产菌株打下了一定的基础。
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